響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取刺梨多糖工藝研究

唐健波，肖 雄，楊 娟，彭 梅*，劉建華

1 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550002;2 貴州省生物技術(shù)研究所，貴陽 550006

刺梨(Rosa roxburghii Tratt，RRT)是貴州特色水果資源，號(hào)稱維C 之王，在貴州已有較大規(guī)模種植栽培，資源十分豐富。刺梨為衛(wèi)生部批準(zhǔn)的食品新資源名單品種，為藥食兩用植物，具有醫(yī)藥保健功能，尤其在增強(qiáng)免疫力、抗動(dòng)脈粥樣硬化、延緩衰老、抗癌防癌、抗突變等方面功效顯著［1-3］，在食品、保健食品、醫(yī)藥領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。多糖作為刺梨中主要藥理成分之一，具有抗氧化［4］、抗缺氧［5］、抗應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)［6］、神經(jīng)營養(yǎng)活性［7］以及對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞谷氨酸損傷有保護(hù)作用［8］等多方面的生物活性，具有很好的開發(fā)利用價(jià)值。目前對(duì)刺梨多糖(Rosa roxburghii Tratt polysaccharide，RRTP)的提取工藝報(bào)道很少，主要還是沿用傳統(tǒng)的熱水提取法［9］，有關(guān)超聲波輔助提取刺梨多糖的工藝研究還未見報(bào)道。

超聲波提取是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度，增大介質(zhì)的穿透力以提取天然產(chǎn)物有效成分的方法［10］。本文以刺梨為試驗(yàn)材料，通過對(duì)刺梨多糖超聲提取過程中超聲時(shí)間、超聲功率、液料比、提取溫度、提取次數(shù)等因素與刺梨多糖提取率關(guān)系的研究，結(jié)合響應(yīng)面對(duì)刺梨多糖提取工藝的優(yōu)化篩選，旨在獲得最佳提取工藝，為貴州省特色果實(shí)刺梨的綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

刺梨干果于2012 年9 月購自貴陽市萬東橋藥材市場(chǎng);濃硫酸、苯酚、葡萄糖、乙醇均為國產(chǎn)分析純;SB25-12DTD 超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司;HP-8453 型紫外可見分光光度計(jì)，惠普公司;MD spectra MAX-190 連續(xù)波長酶標(biāo)儀，美國MD公司;AL204 梅特勒電子分析天平，梅特勒·托利多儀器(上海)有限公司;DZF-6021 型真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，TDL-40C 低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

刺梨干果7400 g 經(jīng)粉碎后，用80%乙醇回流提取8 次，每次2 h，抽濾得固體粉末，經(jīng)干燥后得樣品3500 g，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 刺梨多糖的提取流程及方法

刺梨多糖超聲波輔助提取工藝流程為:刺梨→干燥、粉碎→乙醇回流除雜→抽濾→殘?jiān)L(fēng)干燥→超聲輔助提取→離心、抽濾→濾液減壓濃縮→醇沉、抽濾→濾餅真空干燥→粗多糖。

取預(yù)處理后的樣品5 g，放入500 mL 梨形瓶中，加入適量水，放入超聲波清洗機(jī)中，在一定功率下提一定時(shí)間，趁熱于4000 rpm 下離心10 min，取上清液抽濾，收集濾液，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄔ僦貜?fù)提取2次。合并濾液，減壓濃縮至一定體積，加入一定量的無水乙醇使溶液中乙醇最終濃度達(dá)到80%。靜置過夜，抽濾，沉淀用無水乙醇洗滌2～3 次后，60 ℃真空干燥至恒重，稱重。同時(shí)用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。

1.2.3 多糖含量測(cè)定方法

采用苯酚-硫酸法，稱取粗多糖10 mg 溶于50 mL 容量瓶中制得0.2 mg/mL 的樣品溶液，取0.8 mL 于試管中，蒸餾水補(bǔ)液至2 mL，然后加入6%的苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，靜置10 min 后搖勻。冷卻至室溫后于490 nm 測(cè)定吸光度，平行測(cè)定三次，以2.0 mL 蒸餾水做空白對(duì)照。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖100 mg 溶于50 mL 容量瓶中，混勻后取1.0 mL稀釋至50 mL 制得0.04 mg/mL 的葡萄糖溶液，分別取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以蒸餾水補(bǔ)液至2.0 mL，然后依次加入6%的苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，靜置10 min 后，搖勻，室溫放置冷卻至室溫后于490 nm 測(cè)定吸光度，以2.0 mL 蒸餾水做空白對(duì)照。橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用超聲時(shí)間、超聲功率、液料比、提取次數(shù)及提取溫度對(duì)提取率起主要影響的5 個(gè)因素，以刺梨多糖的提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素考察。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，對(duì)超聲輔助提取刺梨多糖的影響因素進(jìn)行了更為深入的研究和條件優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定液料比30 mL/g，提取時(shí)間10 min，提取溫度60 ℃，提取次數(shù)3 次，考察不同的超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。由圖1 可看出，隨著超聲時(shí)間的延長，吸光度值快速上升，到了20 min 左右時(shí)，吸光度值基本保持不變，因此確定超聲時(shí)間為20 min。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction yield of RRTP

2.1.2 超聲功率對(duì)刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定液料比30 mL/g，提取時(shí)間20 min，提取溫度60 ℃，提取次數(shù)3 次，考察不同的超聲功率對(duì)多糖提取率的影響。由圖2 可看出，隨著超聲功率的升高，吸光度值先略有升高，之后快速下降，在240 W 時(shí)有一個(gè)峰值，說明在功率240 W 時(shí)提取率達(dá)到最高。分析原因可能是因?yàn)楦吖β实某暡▽?duì)刺梨多糖有一定的破壞作用，從而導(dǎo)致多糖得率的下降。

圖2 超聲功率對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of RRTP

2.1.3 液料比對(duì)刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定提取時(shí)間20 min，提取溫度60℃，超聲功率240 W，提取次數(shù)3 次，考察不同的液料比對(duì)多糖提取率的影響。由圖3 可看出，隨著液料比的升高，吸光度值先上升，然后逐漸下降，在液料比為30 mL/g 時(shí)吸光值最大，說明此時(shí)的提取率最高。分析原因可能是隨著液料比的升高，其他成分的溶出也相對(duì)增多，從而抑制了多糖的溶出。因此確定液料比為30 mL/g。

圖3 液料比對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on extraction yield of RRTP

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定提取時(shí)間20 min，提取溫度60℃，超聲功率240 W，料液比30 mL/g，考察不同的提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響。由圖4 可看出，隨著提取次數(shù)的增加，吸光度值先逐步升高，在提取次數(shù)達(dá)到3 次時(shí)，吸光度值趨于穩(wěn)定，說明提取3 次后提取率基本不再上升，而隨著提取次數(shù)的增加所耗費(fèi)的成本也急劇增加，綜合各種因素考慮選定提取3 次為宜，既減少后期濃縮的困難，又節(jié)省能耗。

圖4 提取次數(shù)對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.4 Effect of times of extraction on extraction yield of RRTP

2.1.5 提取溫度對(duì)刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定提取時(shí)間20 min，超聲功率240 W，料液比30 mL/g，提取次數(shù)3 次，考察不同的提取溫度對(duì)多糖提取率的影響。由圖5 可看出，隨著提取溫度的升高，吸光度值快速上升，達(dá)到60 ℃后上升趨勢(shì)減緩，上升到80 ℃時(shí)達(dá)到所取范圍內(nèi)的最高值。分析原因是:隨著溫度的升高，熱效率升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，利于刺梨多糖的溶出，但溫度過高可能對(duì)多糖結(jié)構(gòu)造成一定的破壞，影響其藥理活性，綜合考慮后選擇70 ℃為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖5 提取溫度對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction yield of RRTP

2.2 刺梨多糖提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間、超聲功率、液料比、提取溫度這4 個(gè)因素，采用4 因素3 水平的響應(yīng)面分析方法求取優(yōu)化的工藝參數(shù)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1，Box-Benhnken 設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and code of response surface experiments

表2 Box-Benhnken 設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experiment design and the results

表3 方差分析表Table 3 ANOVA of regression analysis

注:* P＜0.05 顯著作用;＊＊ P＜0.01 高度顯著作用;＊＊＊ P＜0.001 極顯著作用。Note:* P＜0.05 significant effect;＊＊ P＜0.01 very significant effect;＊＊＊ P＜0.001 extremely significant effect.

利用軟件Design-Expert8.06 程序進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析，經(jīng)對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程為:

從表3 可以看出，模型的F 檢驗(yàn)結(jié)果為P＜0.0001，表明該回歸方程模型極其顯著，且模型失擬項(xiàng)P=0.5885＞0.05 不顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9770，說明模型擬合程度很好。校正系數(shù)0.9539 說明該模型能解釋95.39%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的4.61%不能用此模型來解釋。因此試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值非常接近，可以用此模型來分析和預(yù)測(cè)超聲波輔助提取刺梨多糖的工藝條件。由表3中的回歸模型方差分析結(jié)果可知，X1、X2、X3、X4、對(duì)刺梨多糖提取率的影響均顯著。

RSM 的圖形是特定的響應(yīng)面Y 對(duì)應(yīng)X1、X2、X3、X4值構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，從所得響應(yīng)面分析圖上可以分析出它們之間的相互作用。

圖6 超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.6 Response surface plot and contour plot effect of ultrasonic power and ultrasonic time on extraction yield of RRTP

圖7 液料比和超聲時(shí)間對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.7 Response surface plot and contour plot effect of liquid to solid ratio and ultrasonic time on extraction yield of RRTP

圖8 提取溫度和超聲時(shí)間對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.8 Response surface plot and contour plot effect of extraction temperature and ultrasonic time on extraction yield of RRTP

圖9 液料比和超聲功率對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.9 Response surface plot and contour plot effect of liquid to solid ratio and ultrasonic power on extraction yield of RRTP

圖10 提取溫度和超聲功率對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.10 Response surface plot and contour plot effect of extraction temperature and ultrasonic power on extraction yield of RRTP

圖11 提取溫度和液料比對(duì)刺梨多糖提取率的影響Fig.11 Response surface plot and contour plot effect of extraction temperature and liquid to solid ratio on extraction yield of RRTP

從響應(yīng)面分析圖6～11 中可以看出響應(yīng)值與影響因素的關(guān)系:提取溫度對(duì)刺梨多糖提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，其次依次超聲時(shí)間、超聲功率、液料比，表現(xiàn)為曲線較平緩。

根據(jù)所得模型，應(yīng)用Design-Expert 軟件分析可預(yù)測(cè)在穩(wěn)定狀態(tài)下的最優(yōu)工藝條件是:超聲時(shí)間30 min，超聲功率132.93 W，液料比40 mL/g，提取溫度80 ℃，提取3 次，刺梨多糖預(yù)測(cè)提取率為2.19%。

為了檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)情況的一致性，根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為:取超聲時(shí)間30 min，超聲功率120 W，液料比40 mL/g，提取溫度80 ℃，提取3 次。在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得刺梨多糖提取率為2.18%。提取率與預(yù)測(cè)結(jié)果契合度為99.54%，二者非常接近，說明該工藝穩(wěn)定可行，適合刺梨多糖的提取。

3 結(jié)論

本研究首先通過單因素試驗(yàn)選定了參與響應(yīng)面試驗(yàn)的提取溫度、超聲功率、超聲時(shí)間、液料比4 個(gè)主要因素并設(shè)立不同水平，然后應(yīng)用響應(yīng)面分析法建立了刺梨多糖提取率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用于生產(chǎn)預(yù)測(cè)。

試驗(yàn)結(jié)果表明提取溫度、超聲功率、超聲時(shí)間、液料比各因素對(duì)刺梨多糖提取率均有顯著影響。綜合考慮各方面的因素，超聲輔助提取刺梨多糖的最優(yōu)工藝為:超聲時(shí)間30 min，超聲功率120 W，液料比40 mL/g，提取溫度80 ℃，提取3 次，此條件下的刺梨多糖提取率可達(dá)2.18%。該結(jié)果可為刺梨多糖的提取研究提供一定的參考價(jià)值，具有一定的實(shí)際應(yīng)用前景。

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