楓楊樹(shù)皮抗菌物質(zhì)的分離鑒定研究

羅 彭，王佳佳，李 兵，郭占京，廖彭瑩，陳 俊，李漢浠，潘為高

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001

楓楊(Pterocarya stenoptera C.DC.)為胡桃科楓楊屬植物［1］，原產(chǎn)我國(guó)，地域分布廣泛、枝條扦插即活，生長(zhǎng)繁殖迅速，屬于極易可再生資源。楓楊在抗腫瘤、抗病毒、殺滅釘螺等方面有一定的藥用價(jià)值;但其更為重要的價(jià)值，是在民間作為傳統(tǒng)外用中藥用于治療各類(lèi)真菌性皮膚病和細(xì)菌性膿、瘡［2］，此用藥習(xí)慣在古籍、古方及當(dāng)代中藥書(shū)籍中均有大量記載，用法是將其樹(shù)皮、樹(shù)葉搗碎用于治療疥癬、腳癬、頭癬［3］和其它病菌性疾?。?］。楓楊抗菌用藥歷史悠久，療效肯定，用藥安全性也得到了時(shí)間的驗(yàn)證。

楓楊的抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)研究，目前才剛剛起步。張興悅［5］等證實(shí)楓楊乙醇或丙酮提取物有抑菌作用，但并未開(kāi)展活性單體層面的研究。筆者前期研究從楓楊樹(shù)皮分離純化得到了一個(gè)抗菌單體5-羥基-2-乙氧基-1，4-萘醌［13］，但研究并不系統(tǒng)。本研究前期發(fā)現(xiàn)楓楊中還有許多尚待分離的潛在抗菌成分。本研究通過(guò)生物活性跟蹤法與現(xiàn)代分離純化技術(shù)結(jié)合，系統(tǒng)地開(kāi)展楓楊的抗菌活性物質(zhì)的追蹤研究，盡可能全面探明其抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，尋找新的抗菌素，同時(shí)為研制抗菌活性部位藥及控制藥材質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥材

藥材采集于廣西桂林興安縣五里峽壩區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為胡桃科楓楊屬植物楓楊(Pterocarya stenoptera C.DC.)的樹(shù)皮。藥材陰干、粉碎，于4 ℃密閉保存。

1.2 試劑

石油醚(30～60 ℃、60～90 ℃兩種沸程規(guī)格)、氯仿(AR)、二氯甲烷(AR)、乙酸乙酯(AR)、無(wú)水乙醇(AR)、丙酮(AR)均由西隴化工股份有限公司生產(chǎn);柱層析硅膠(100～200、200～300 目)和薄層層析硅膠H(60 型)購(gòu)于青島海洋化工集團(tuán)公司;10 cm×20 cm 硅膠G 板為武安市誠(chéng)朋科技開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品;Sephadex LH-20 葡聚糖為瑞士安瑪西亞產(chǎn)品。

1.3 菌種

卡拉雙球菌(Dipococcus cata)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙 門(mén) 氏 菌(Salmonella sp.)、白 色 念 球 菌(canidia Albicans)、棉花球菌(Cotton cocci)、鞭毛菌(Mastigomycotina)、放線菌(Actinomycete)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、姜瘟菌(Pseudomonas solanacearum)、小麥赤霉(Fusarium graminerum)、玉米大斑菌(Exserohilum-trucicum)、墨入菌(Phoma wasabiae)等菌種由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物研究室提供。

1.4 儀器與設(shè)備

HD-650 超凈臺(tái)(吳江市偉峰凈化設(shè)備有限公司);DZF-2001 真空干燥箱(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠);RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);100～1000 μL 量程及10～100 μL 量程移液槍(Eppendorf);Mettler-AE100 電子分析天平(瑞士Mettler公司);Bruker Avance-600 型和Bruker AM-400 型核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司);Agilent 6890/5973N 型GC-MS 聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 抗菌活性的測(cè)定方法

2.1.1 肉湯瓊脂培養(yǎng)基的配制

蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉浸膏3 g，瓊脂20 g，水1000 mL，加熱溶化后濾過(guò)，用pH 計(jì)調(diào)pH 值至7.4～7.6，0.15 Mpa 滅菌20 min，待用(細(xì)菌、真菌在此培養(yǎng)基上均能良好生長(zhǎng))。

2.1.2 藥物配制

用于實(shí)驗(yàn)的各化合物(藥物)均進(jìn)行干燥，徹底除去溶劑。藥物用滅菌注射用水配制，用少量無(wú)菌DMSO 助溶，均配成統(tǒng)一濃度10 g/L(1.0%)。

2.1.3 瓊脂平板打孔法測(cè)定抗菌活性(一菌多藥，定性測(cè)定)

在無(wú)菌平皿內(nèi)加入熔化的肉湯瓊脂培養(yǎng)基，凝固后作為底層(厚約0.5 cm);再取50 ℃熔化的肉湯瓊脂培養(yǎng)基，鋪在底層之上，凝固后作為上層(厚約0.5 cm)。用推平板接種法，將供試驗(yàn)菌液均勻地涂布于瓊脂平板的表面，用無(wú)菌打孔器打孔，孔徑0.5 cm，只打穿上層瓊脂，孔距2 cm，均勻分布。用移液器分別吸取各藥液約90 μL 加于各瓊脂孔內(nèi)。于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察孔周?chē)袩o(wú)抑菌圈，通過(guò)抑菌圈的大小比較各藥物的抗菌效力。

2.2 抗菌活性成分的分離純化

楓楊樹(shù)皮粗粉3.0 kg，用約30 倍量90%乙醇滲漉提取，濾液負(fù)壓濃縮回收溶劑，敞口水浴揮發(fā)得乙醇干膏約300.0 g。藥材殘?jiān)?，再?0 倍量水滲漉提取，濾液濃縮干燥后得水提取干膏約233.0 g。

進(jìn)行抗菌測(cè)定，發(fā)現(xiàn)水提取物對(duì)各菌無(wú)明顯抑制作用，90%乙醇提取物對(duì)卡拉雙球菌、白色念球菌、棉花球菌、鞭毛菌、放線菌、大腸桿菌、姜瘟菌、金黃色葡萄球菌、玉米彎孢菌、玉米大斑菌、墨入菌均具有不同程度的抑制作用，其中對(duì)卡拉雙球菌、小麥亦霉的抑制作用最強(qiáng)。故而后續(xù)抗菌活性成分的分離純化起始部位采用90%乙醇提取物，選用抗菌效果最為顯著的卡拉雙球菌(細(xì)菌)、小麥赤霉(真菌)作為篩選活性成分的實(shí)驗(yàn)用菌。

300 g 乙醇提取物用適量熱水懸浮，用60～90℃沸程石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得石油醚部位51 g、氯仿部位42 g、乙酸乙酯部位44 g、正丁醇部位77 g、水層部位86 g，經(jīng)抗菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯仿部位有很強(qiáng)的抗菌作用，石油醚部位、乙酸乙酯部位抗菌作用較弱，正丁醇部位和水層部位無(wú)抗菌作用。

40 g 氯仿部位用甲醇熱溶，適量硅膠分散制樣并干燥。1000 g 硅膠(100～200 目，柱內(nèi)徑10 cm)濕法裝柱，上樣，用氯仿:甲醇梯度洗脫(80∶1→40∶1→20∶1→10∶1→5∶1→甲醇)，得6 個(gè)梯度流份。經(jīng)體外抗菌指標(biāo)檢測(cè)，40∶1、10∶1、5∶1 流份段有高活性，其余流份段無(wú)活性。

將上述40∶1 流份段(量較大)上硅膠中柱(200～300 目，柱內(nèi)徑5 cm，高20 cm)，用石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫(20∶1→10∶1→甲醇)，得到3 個(gè)梯度流份，經(jīng)體外抗菌指標(biāo)檢測(cè)，其中10∶1、甲醇流份段為高活性段，20∶1 流份段為低活性段。將10∶1 流份段上硅膠小柱(薄層硅膠H，柱內(nèi)徑2 cm，高30 cm，N2加壓)，經(jīng)石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫(10∶1→甲醇)，得紅色針狀結(jié)晶1(24 mg)、2(20 mg)和甲醇段，經(jīng)體外抗菌指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)晶1、2 均有明顯的抑菌效果，而甲醇段無(wú)活性。

將上述40∶1 中得到的高活性甲醇流份段直接上硅膠小柱，經(jīng)石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫(4∶1→2∶1→乙酸乙酯)，在2∶1 梯度洗脫時(shí)分離得到黃色針狀結(jié)晶3(10 mg)，經(jīng)抗菌指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)晶3 有明顯的抑菌效果，其余流份段無(wú)活性。

將乙酸乙酯部位(28 g)上硅膠大柱，用二氯甲烷∶甲醇梯度洗脫，在5∶1 梯度得到淺黃色針狀結(jié)晶4，經(jīng)體外抗菌指標(biāo)檢測(cè)，有明顯的抑菌效果。

對(duì)抗菌活性結(jié)晶1、2、3、4 分別用Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠色譜柱進(jìn)行除雜，二氯甲烷∶甲醇(1∶1)洗脫，得到各高純度單體，經(jīng)TLC 薄層確定純度，用于結(jié)構(gòu)研究。

2.3 抗菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

EI-MS 在Agilent 6890/5973N 型GC-MS 聯(lián)用儀上進(jìn)行，電離方式EI+，電子能量70 eV，掃描范圍50～1000 Da。

1D NMR(1H、13C、DEPT)和2D NMR(HSQC、1H-1H COSY、HMBC)在Bruker Avance-600 型和Bruker AM-400 型核磁共振波譜儀上進(jìn)行。1H 頻率為600(或400 MHz)，13C 頻率為125(或100)MHz，溶劑為CDCl3或CD3OD，TMS 為內(nèi)標(biāo)，常溫20 ℃測(cè)定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

化合物1 紅色針狀結(jié)晶，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇，不溶于水。三種不同的展開(kāi)劑系統(tǒng)進(jìn)行硅膠TCL 檢測(cè)，氨顯，均為粉紅色單斑［石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)，Rf=0.40;石油醚∶丙酮(6∶1)，Rf=0.0.48;氯仿∶甲醇(60∶1)，Rf=0.83］，純度符合波譜測(cè)定要求。EI-MS m/z∶174［M］+(基峰)，146，118，92，63.綜合分析化合物1 的1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、1H-1H COSY 和HMBC 數(shù)據(jù)(表1)，并參照文獻(xiàn)［6］，確定該化合物為5-羥基-1，4-萘醌(C10H6O3，M=174，胡桃醌，圖1)。

化合物2 紅色針狀結(jié)晶，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇，不溶于水。三種不同的展開(kāi)劑系統(tǒng)進(jìn)行硅膠TCL 檢測(cè)，氨顯，均為粉紅色單斑［石油醚∶乙酸乙酯(2∶1)，Rf=0.65;石油醚∶丙酮(4∶1)，Rf=0.43;氯仿∶甲醇(80∶1)，Rf=0.62］，純度符合波譜測(cè)定要求。EI-MS m/z∶204［M］+(基峰)，174，147，105，63.綜合分析化合物2 的1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、1H-1H COSY 和HMBC 數(shù)據(jù)(表1)，并參照文獻(xiàn)［7］，確定該化合物為5-羥基-2-甲氧基-1，4-萘醌(C11H8O4，M=204，圖1)。

化合物3 黃色針狀結(jié)晶，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿，不溶于甲醇、水。三種不同的展開(kāi)劑系統(tǒng)進(jìn)行硅膠TCL 檢測(cè)，紫外下均顯暗紫色單斑［石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)，Rf=0.42;石油醚∶丙酮(2∶1)，Rf=0.43;氯仿∶甲醇(30∶1)，Rf=0.75］，純度符合波譜測(cè)定要求。EI-MS m/z∶168［M］+，153，127，97，69(基峰)，50。綜合分析化合物3 的1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、1H-1H COSY 和HMBC 數(shù)據(jù)(表1)，并參照文獻(xiàn)［8］，確定該化合物為2，6-二甲氧基-1，4-對(duì)苯醌(C8H8O4，M=168，圖1)。

化合物4 淺黃色針狀結(jié)晶，溶于甲醇，不溶于氯仿。三種不同的展開(kāi)劑系統(tǒng)進(jìn)行硅膠TCL 檢測(cè)，硫酸-乙醇顯色及碘顯色，均為棕黃色單斑［環(huán)己烷∶乙酸乙酯(6∶1)，Rf=0.74;石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸(40∶10∶1)，Rf=0.70;氯仿∶甲醇∶冰醋酸(9∶4∶1)，Rf=0.54］，純度符合波譜測(cè)定要求。EI-MS m/z:170［M］+(基峰)，153，152，125，77;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.06(2H，s，H-2，6);13C NMR和DEPT(100 MHz，CD3OD)δ:170.5(C-7，C)，146.4(C-3，5，C)，139.6(C-4，C)，121.9(C-1，C)，110.3(C-2，6，CH)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［9］的沒(méi)食子酸的數(shù)據(jù)一致，因此化合物4 鑒定為3，4，5，-三羥基苯甲酸(C7H6O5，M=170，圖1)。

表1 化合物1、2、3 的一維和二維核磁譜數(shù)據(jù)(600/150 MHz to TMS，CDCl3)Table 1 1D-and 2D NMR spectral data of compounds 1，2 and 3(in CDCl3at 600/150 MHz to TMS)

圖1 化合物1、2、3 和4 的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of compound 1，2，3 and 4

4 討論

本研究通過(guò)生物活性跟蹤法結(jié)合現(xiàn)代分離純化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)楓楊乙醇提取物及其氯仿萃取部位有明顯抑菌作用，而石油醚或乙酸乙酯部位抑菌作用較弱，正丁醇或水部位無(wú)抗菌作用;首次從氯仿部位和乙酸乙酯部位篩選出4 個(gè)高活性抗菌單體，分別為5-羥基-1，4-萘醌(1)、5-羥基-2-甲氧基-1，4-萘 醌(2)、2，6-二甲氧基-1，4-對(duì)苯醌(3)、沒(méi)食子酸(4)。本研究采用化學(xué)結(jié)合生物活性追蹤法得到的抗菌活性單體，與一般的化學(xué)方法分離得到的化學(xué)成分的方式有所區(qū)別，同時(shí)所有活性成分均為首次從楓楊中獲得。

5-羥基-1，4-萘醌(1)又名胡桃醌，抗菌譜廣，抗菌效價(jià)高，主要在對(duì)數(shù)期，通過(guò)破壞菌體的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)［10］。2，6-二甲氧基-1，4-對(duì)苯醌(3)抗菌譜廣，在很低濃度下即可殺滅多種致病性細(xì)菌、真菌［11］。沒(méi)食子酸(4)對(duì)6 種常見(jiàn)食源性致病菌和腐敗菌的最小抑菌濃度為0.125～4.000 mg/mL，主要抑制菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的分裂［12］。除了本研究所篩選到的4 個(gè)高活性抗菌單體，筆者先前已從楓楊樹(shù)皮篩選鑒定出另一個(gè)高活性抗菌單體5-羥基-2-乙氧基-1，4-萘醌［13］，經(jīng)抗菌測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)抗菌譜較廣，對(duì)多種細(xì)菌、真菌有顯著拮抗作用，抗菌活性強(qiáng)度近似于左氧氟沙星［14］。該物質(zhì)與5-羥基-2-甲氧基-1，4-萘醌(2)在結(jié)構(gòu)上只是取代基(乙氧基、甲氧基)的差異。

可見(jiàn)楓楊抗菌成分類(lèi)別或化學(xué)結(jié)構(gòu)母核豐富，其抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)由一系列(目前發(fā)現(xiàn)5 個(gè))的抗菌活性物質(zhì)組成，它們的碳骨架分別屬于苯醌(1 個(gè))、萘醌(3 個(gè))、苯甲酰(1 個(gè))三類(lèi)化學(xué)母核。

楓楊樹(shù)皮外用抗菌用藥歷史悠久，療效肯定;楓楊植物地域分布廣，極易再生，資源優(yōu)勢(shì)明顯。本研究及前期研究發(fā)現(xiàn)楓楊集3 類(lèi)抗菌結(jié)構(gòu)母核、5 個(gè)抗菌成分于一身，是一味難得的抗菌中藥;多類(lèi)別的抗菌單體，可能從多機(jī)理途徑、多靶位點(diǎn)發(fā)揮抗菌療效，為開(kāi)發(fā)出不易產(chǎn)生耐藥性的外用抗菌部位藥提供理論基礎(chǔ)。本研究揭示的多抗菌母核組成的楓楊抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)，也為楓楊藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定奠定了基礎(chǔ)。

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