反柄紫芝中二個(gè)新生物堿

田 磊，王心龍，王彥志，程永現(xiàn)*

1 河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州 450008;2中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201

靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，素有“仙草”之美稱，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品［1］，靈芝屬種類(lèi)較多，《中華人民共和國(guó)藥典》僅收載了赤芝(Ganoderma lucidum)或紫芝(G.sinensis)的干燥子實(shí)體作為藥材正品來(lái)源［2］，其實(shí)靈芝屬多種真菌在我國(guó)民間被廣泛應(yīng)用并在藥材市場(chǎng)流通。以往研究發(fā)現(xiàn)靈芝可調(diào)節(jié)人體代謝和內(nèi)分泌功能，對(duì)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等均具有較好的干預(yù)效果，同時(shí)還具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、抗炎等作用［3］，臨床上或民間被廣泛用于治療多種疾病，如慢性支氣管炎、消化不良、神經(jīng)衰弱、慢性肝炎、高血壓、腫瘤、AIDS 等［4］。雖然靈芝屬的研究已進(jìn)行多年，但其化學(xué)成分多局限于三萜、多糖和生物堿［5，6］，近年，我們從靈芝中發(fā)現(xiàn)了一系列活性雜萜，引起了業(yè)界高度關(guān)注［7-9］。反柄紫芝與紫芝功能相近，形態(tài)上反柄紫芝的柄是反背而生，前期我們對(duì)其進(jìn)行了研究，曾報(bào)道靈芝雜萜cochlearols A和B 的結(jié)構(gòu)及其腎保護(hù)作用［10］。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行深入研究過(guò)程中，從中分離得到6 個(gè)化合物，其中2個(gè)為新生物堿，該研究將進(jìn)一步豐富人們對(duì)靈芝化學(xué)的認(rèn)識(shí)。

1 儀器與材料

Shimazu UV2401PC 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，Waters Xevo TQ-S 質(zhì)譜儀及API QSTAR Pulsar i 質(zhì)譜儀;Bruker AM-400 及Avance III 600 MHz 核磁共振儀(TMS 作為內(nèi)標(biāo)，δ 為ppm，J 為Hz);200～300目柱色譜用硅膠、硅膠H 和GF254 薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠);45～75 μm MCI gel CHP 20P(日本三菱公司產(chǎn)品);25～100 μm Sephadex LH-20(Pharmacia 公司);40～63 μm RP-18(日本Daiso)。

反柄紫芝于2013 年9 月購(gòu)自中國(guó)廣東省廣州同康藥業(yè)有限公司，樣品經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所楊祝良研究員鑒定，憑證標(biāo)本(CHYX-0570)保存于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

取反柄紫芝子實(shí)體100 kg，粉碎后用70%的乙醇室溫提取(6×300 L×48 h)，濃縮得總提物(10 kg)?？偺嵛镉盟m當(dāng)稀釋后用乙酸乙酯萃取3 次，得到乙酸乙酯部分2 kg。經(jīng)硅膠色譜柱進(jìn)行分離，以氯仿-甲醇(100∶1～1∶1)梯度洗脫，得到7 個(gè)組分(F1～F7)。F5(61 g)經(jīng)MCI gel CHP 20P 柱以甲醇-水(10%～100%)梯度洗脫得到3 個(gè)組分(F5.1、F5.2、F5.3)。F5.2(14 g)經(jīng)正相柱硅膠色譜柱，以氯仿-甲醇(50∶1～1∶1)梯度洗脫得到4 段組分(F5.2.1～F5.2.4)。F5.2.3(3 g)經(jīng)Sephadex LH-20 柱(MeOH)，RP-18 柱，以甲醇-水(50%～70%)洗脫，得到化合物1(4 mg)和2(1 mg)。F5.2.4(4 g)經(jīng)MCI gel CHP 20P 柱，以甲醇-水(10%～50%)梯度洗脫，制備薄層，用氯仿-甲醇(10∶1)展開(kāi)，再經(jīng)Sephadex LH-20 柱(MeOH)，得化合物3(2 mg)。F5.3(5 g)經(jīng)RP-18 柱，以甲醇-水(60%～90%)洗脫，再經(jīng) Sephadex LH-20 柱(MeOH)，得化合物4(2 mg)、5(6 mg)和6(1 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色粉末，由13C NMR、DEPT 譜及高分辨質(zhì)譜{m/z:228.1022［M+H］+(calcd for C14H14NO2，228.1025)}確定其分子式為C14H13NO2，計(jì)算其不飽和度為9。化合物1 的1H NMR 譜芳香區(qū)出現(xiàn)三個(gè)質(zhì)子信號(hào)［δH7.27(1H，brs)，δH6.78(2H，overlapped)］，提示結(jié)構(gòu)中可能含有一個(gè)ABX 系統(tǒng);低場(chǎng)區(qū)的二個(gè)質(zhì)子信號(hào)δH8.38(1H，s)和δH7.85(1H，s)，提示結(jié)構(gòu)中還可能含有一個(gè)1，2，4-三取代芳雜環(huán);高場(chǎng)區(qū)顯示三個(gè)亞甲基信號(hào)［δH3.02(2H，t，J=7.5 Hz)，δH2.98(2H，t，J=7.5 Hz)，δH2.15(2H，q，J=7.5 Hz)］。13C NMR 和DEPT 譜顯示14個(gè)碳信號(hào)，包括3 個(gè)sp3雜化的亞甲基，5 個(gè)sp2雜化的次甲基，6 個(gè)烯區(qū)/芳香區(qū)季碳。以上信號(hào)與化合物sinensine D 相似［11］，提示它們是類(lèi)似物，其區(qū)別在于化合物sinensine D 的6-OH 在化合物1 中消失，這可從1H-1H COSY 譜中H-4/H-5/H-6(δH2.98)的相關(guān)加以證明(圖1)，同時(shí)，H-4/C-3，C-9和H-6/C-7，C-8 的HMBC 相關(guān)也進(jìn)一步表明了五元環(huán)的連接位置(圖1)。化合物1 與sinensine D 的另一區(qū)別是化合物sinensine D 中的酚羥基已成環(huán)，而化合物1 中的2'-OH 是游離的，這可由1H NMR(DMSO-d6)譜顯示兩個(gè)游離羥基質(zhì)子信號(hào)5'-OH(1H，δH8.88，s)和2'-OH(1H，δH13.63，s)得到證明。另外，HMBC 譜中H-6'/C-2，C-5'(δC112.9)的相關(guān)進(jìn)一步證明了苯環(huán)上OH 位置。因此，化合物1 的結(jié)構(gòu)得以確定，其為一個(gè)新的生物堿，命名為ganocochlearine A。

圖1 化合物1 的關(guān)鍵HMBC 和COSY 相關(guān)Fig.1 Key HMBC and COSY correlations for compound 1

化合物2 黃色粉末，由13C NMR、DEPT 譜及高分辨質(zhì)譜{m/z:242.1177［M+H］+(calcd for C15H16NO2，242.1181)}確定其分子式為C15H15NO2，計(jì)算其不飽和度為9。1H NMR 譜和13C NMR 譜與化合物1 相比較較為相似，提示它們是類(lèi)似物，其區(qū)別在于化合物2 較化合物1 多了一個(gè)甲基信號(hào)，HMBC譜中H3-10/C-6，C-7，C-8 的相關(guān)表明H3-10 與C-6相連?；衔? 和2 的另一區(qū)別是五元環(huán)的位置發(fā)生了變化。HMBC 譜中H-3/C-9，C-2，H-6'，H-7/C-2，H-5/C-8，C-6 的相關(guān)表明了五元環(huán)的連接位置(圖2)。至此可確定化合物2 為一個(gè)新的生物堿，命名為ganocochlearine B。

圖2 化合物2 的關(guān)鍵HMBC 和COSY 相關(guān)Fig.2 Key HMBC and COSY correlations for compound 2

化合物1 黃色粉末，UV(MeOH)λmax(log ε)343(3.83)，265(4.15)，213(4.41)nm;ESI-MS:m/z 228［M+H］+，HR-ESI-MS:m/z 228.1022［M+H］+(calcd for C14H14NO2，228.1025);1H NMR(400 MHz，CD3OD)及13C NMR(150 MHz，CD3OD)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

化合物2 黃色粉末，UV(MeOH)λmax(log ε)336(3.33)，255(3.64)，205(4.10)nm;ESI-MS:m/z 242［M+H］+，HR-ESI-MS:m/z 242.1177［M+H］+(calcd for C15H16NO2，242.1181);1H NMR(600 MHz，CD3OD)及13C NMR(150 MHz，CD3OD)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 化合物1 和2 在氘代甲醇中的核磁共振數(shù)據(jù)Table 1 NMR data of 1 and 2 in methanol-d4(δ，ppm)

化合物3 淡黃色粉末，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:8.26(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.97(1H，d，J=7.2 Hz，H-3)，7.70(1H，m，H-7)，7.59(1H，d，J=8.0 Hz，H-8)，7.42(1H，m，H-6)，6.34(1H，d，J=7.2 Hz，H-2);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:141.6(C-2)，109.8(C-3)，180.7(C-4)，126.7(C-5)，125.3(C-6)，133.5(C-7)，119.6(C-8)，141.6(C-9)，126.1(C-10)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)［12］基本一致，故確定化合物3 為2，3-dihydro-4(1H)-quinolone。

化合物4 淡黃色粉末，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.94(1H，d，J=7.2 Hz，H-3)，7.71(1H，dd，J=8.2，0.8 Hz，H-5)，7.24(1H，t-like，J=8.0 Hz，H-6)，7.12(1H，dd，J=7.6，0.8 Hz，H-7)，6.36(1H，d，J=7.2 Hz，H-2);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:132.3(C-2)，109.7(C-3)，180.8(C-4)，115.5(C-5)，116.0(C-6)，125.3(C-7)，148.3(C-8)，140.5(C-9)，127.8(C-10)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)［12］基本一致，故確定化合物4 為8-hydroxy-2，3-dihydro-4(1H)-quinolone。

化合物5 白色粉末，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:3.39(1H，d，J=11.0 Hz，Ha-28)，3.15(1H，d，J=11.0 Hz，Hb-28)，2.63(1H，overlapped，Ha-12)，2.43(1H，d，J=18.2 Hz，Hb-12)，2.40(1H，overlapped，Ha-1)，2.36(1H，overlapped，Ha-2)，2.33(1H，overlapped，Ha-23)，2.24(1H，overlapped，Hb-23)，2.19(1H，overlapped，H-5)，2.19(1H，overlapped，Hb-2)，2.16(2H，overlapped，H-6)，2.08(1H，overlapped，Ha-16)，1.94(1H，overlapped，Ha-15)，1.85(1H，overlapped，Ha-22)，1.82(1H，overlapped，Hb-1)，1.77(1H，overlapped，H-17)，1.52(1H，overlapped，H-20)，1.51(1H，overlapped，Hb-16)，1.48(1H，overlapped，Hb-15)，1.38(3H，s，H-19)，1.38(3H，s，H-29)，1.33(1H，overlapped，Hb-22)，1.06(3H，s，H-30)，1.01(3H，s，H-18)，0.91(3H，d，J=6.4 Hz，H-21);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:38.2(C-1)，30.2(C-2)，176.3(C-3)，87.9(C-4)，48.6(C-5)，32.6(C-6)，74.1(C-7)，163.6(C-8)，136.4(C-9)，42.2(C-10)，202.4(C-11)，51.5(C-12)，46.2(C-13)，52.0(C-14)，30.2(C-15)，27.8(C-16)，51.1(C-17)，18.3(C-18)，25.6(C-19)，37.1(C-20)，18.3(C-21)，32.0(C-22)，31.9(C-23)，176.3(C-24)，71.4(C-28)，24.9(C-29)，24.8(C-30)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)［13］基本一致，故確定化合物5 為fornicatin A。

化合物6 白色粉末，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.24(5H，m，Ar-H)，4.32(1H，m，H-6)，3.72(1H，m，H-3)，3.25(1H，d，J=4.7 Hz，Ha-11)，3.0(1H，dd，J=13.8，4.7 Hz，Hb-11)，1.42(1H，m，H-7)，0.72(3H，d，J=8.0 Hz，H-9)，0.67(3H，d，J=4.0 Hz，H-10);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:169.3(C-2，C-5)，60.8(C-3)，57.2(C-6)，39.8(C-7)，24.7(C-8)，12.0(C-9)，15.3(C-10)，39.7(C-11)，137.0(C-12)，131.7(C-13，C-17)，129.5(C-14，C-16)，128.2(C-15)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)［14］基本一致，故確定化合物6 為(3S，6S)-3-［(1'S)-1-methylpropyl］-6-(phenylmethyl)-piperazine-2，5-dione。

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