天然植物多糖分離純化技術(shù)研究現(xiàn)狀和進(jìn)展

鄒 勝，徐 溢，3*，張 慶

1 重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;2新型微納器件與系統(tǒng)技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室;3微納系統(tǒng)及新材料技術(shù)國際研發(fā)中心，重慶 400030

多糖(polysaccharide)是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸之外的另一類具有重要作用的生物大分子，也是機(jī)體內(nèi)不可缺少的組成部分。多糖在自然界分布廣泛，與許多疾病病理過程以及衰老過程密切相關(guān)。探索多糖先導(dǎo)藥物并加以改造、合成已成為當(dāng)今生命科學(xué)界、醫(yī)藥學(xué)界的熱點(diǎn)［1］。植物多糖具有多羥基醛的結(jié)構(gòu)，由10 個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵聚合而成，分子量高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、提取難度大、合成難度大，植物多糖的有效分離純化是進(jìn)行多糖結(jié)構(gòu)和生物活性研究的首要前提。因此，為對植物多糖的結(jié)構(gòu)及藥理藥效等進(jìn)行深入研究，選擇效率高的分離純化方法具有重要的意義。

1 天然植物多糖的提取方法

植物多糖提取的宗旨是在不破壞多糖基本性質(zhì)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)有效提取，多糖是極性大分子，一般不溶于有機(jī)溶劑，難溶于冷水，易溶于熱水，多糖的傳統(tǒng)提取方法多為熱水提取。對于有些酸性多糖，或分子量較大的多糖，通常先用熱水法提取，然后殘?jiān)儆孟A溶液提取，這樣可將大部分多種類型的多糖提取出來。熱水提取法在多數(shù)植物多糖的提取中得到應(yīng)用，如穿龍薯蕷多糖、香菇多糖及佛手多糖等的提?。?-4］。為提高多糖的提取效率，在傳統(tǒng)的水提法基礎(chǔ)上引入一些輔助手段如添加特異性的酶、超聲、微波、高壓等方法的使用，為不同環(huán)境下多糖的獲取提供了可靠支持。

1.1 微波輔助提取法

多糖是一類親水性大分子，與其他親脂性物質(zhì)在微波場中吸收微波能力存在差異，利用微波能的加熱效應(yīng)來加速溶劑對物料中多糖組分的溶解，可提高萃取效率并具有較好的選擇性［5］。微波輔助法能縮短提取時(shí)間，減少溶劑用量、促進(jìn)有效物質(zhì)溶出，顯著地提高提取效率，廣泛應(yīng)用于香椿葉多糖、山茱萸多糖和卷丹多糖的提?。?-8］。

1.2 超高壓提取技術(shù)

天然植物中獲取胞內(nèi)多糖時(shí)，細(xì)胞壁在一定程度上阻礙了胞內(nèi)多糖的提取效率，在常溫下可利用超高壓力作用于物料，迫使細(xì)胞壁破裂，釋放出胞內(nèi)多糖并溶于提取溶劑中達(dá)到提取的目的［9］。敬思群等［10］運(yùn)用超高壓技術(shù)提取金雞菊多糖，極大的縮短提取時(shí)間，降低提取溫度，保護(hù)多糖免受高溫的影響。Chen［11］等采用超高壓提取技術(shù)提取冬蟲夏草多糖，通過響應(yīng)面分析法(RSM)獲得最佳的提取條件，保證多糖的生理活性的前提下最大限度獲取冬蟲夏草的多糖成分。

1.3 酶提取法

酶提取法是一種較溫和并能有效提高多糖提取效率的提取方法，用酶處理天然植物的細(xì)胞壁組織，破壞其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，或切斷多糖與組織中蛋白質(zhì)的結(jié)合，可以促進(jìn)多糖的有效提取。Chen 等［12］應(yīng)用葡萄糖氧化酶法提取黃芪多糖，響應(yīng)面分析法確定最佳的條件下的提取效率為29.96±0.14%。You等［13］優(yōu)化了酶法提取山茱萸多糖的條件使得多糖提取率為9.29±0.31%，與傳統(tǒng)方法比較提取效率更高。

1.4 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法是一種通過機(jī)械破壁而提高多糖的提取效率的方法，該法有別于酶輔助破壁的方法，其操作條件更簡單且易控制，在當(dāng)歸多糖、紅參果多糖和黃芪多糖的提取中都得到了充分的應(yīng)用，提取時(shí)能耗明顯降低［14-16］。但值得提出的是，多糖的活性很大程度上依賴其結(jié)構(gòu)性質(zhì)［17］，超聲提取時(shí)，功率過大、超聲時(shí)間過長均可引起多糖結(jié)構(gòu)的改變，多糖的生理活性也隨之改變。

1.5 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法以其溫和的提取操作條件，提高多糖提取效率的同時(shí)保持多糖原始結(jié)構(gòu)方面顯示出優(yōu)勢。超臨界流體萃取技術(shù)應(yīng)用于天然多糖的提取，沒有有機(jī)溶劑殘留，且對提取出的多糖本身的結(jié)構(gòu)沒有破壞［18］。Chen 等［19］運(yùn)用超臨界萃取方法提取艾草種子的多糖組分，在設(shè)計(jì)的最佳提取條件下:提取壓力為45 MPa、溫度為45℃、二氧化碳流速為20 L/h、提取時(shí)間為2 h，多糖的提取效率為18.59%(w/w)。

1.6 雙水相萃取

雙水相萃取技術(shù)在多糖的提取中應(yīng)用相對較少，但其分離操作簡單、條件溫和，可在接近生理環(huán)境的條件下進(jìn)行提取和分離，在萃取多糖時(shí)不會引起活性多糖性質(zhì)的改變，目前多用于實(shí)驗(yàn)室研究，在工業(yè)化生產(chǎn)中該方法在也具有一定的實(shí)用前景。如在螺旋藻多糖和香菇多糖的分離時(shí)運(yùn)用乙醇/硫酸銨雙水相體系、聚乙二醇(PEG)-硫酸銨雙水相體系進(jìn)行萃取分離，結(jié)果對應(yīng)多糖的產(chǎn)率分別達(dá)到84.5%和57.42%，相較于傳統(tǒng)方法具有很大的提高［20，21］。

實(shí)現(xiàn)天然植物多糖的有效提取是多糖分析的首要步驟，綜述當(dāng)前多糖的提取方法如表1 所示。

表1 天然植物多糖提取方法比較表Table 1 Comparison of extraction methods for polysaccharides from natural plants

上述多種提取法在提取效率上優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法，但必須注意的是在多糖提取時(shí)必須保證多糖的基本性質(zhì)不發(fā)生改變，如微波、超聲、酶解都有可能造成多糖結(jié)構(gòu)的改變，而糖類成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，性質(zhì)各異，相應(yīng)的提取方法也就很難整齊劃一。因此，需了解物種特性、依據(jù)實(shí)際情況并結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研來設(shè)計(jì)提取方案。

2 天然植物多糖的純化技術(shù)

天然植物有效提取后獲得的粗多糖尚難以滿足多糖結(jié)構(gòu)和活性研究的需要，必須采用適當(dāng)?shù)氖侄纬シ翘穷愲s質(zhì)，并將混合多糖分離純化成化學(xué)組成、聚合度和分子形狀相同的均一多糖。多糖的純化方法可按純化機(jī)制和過程大致可分為三類:一是基于分子量大小和溶解度差異的物理分離過程，二是基于分子間作用力的柱層析分離純化法，第三即化學(xué)沉淀法。

2.1 物理分離過程

2.1.1 膜分離法

膜分離技術(shù)是以壓力差、濃度差、電位差等為動(dòng)力，依據(jù)相對分子量的不同進(jìn)行的分離過程，具有分子篩作用，常用于除雜和分離純化大分子物質(zhì)。如采用無機(jī)陶瓷微濾膜處理蟲草菌絲體的粗多糖溶液可以很好的實(shí)現(xiàn)去除溶液中的無機(jī)鹽和小分子肽等物質(zhì)［22］。分離丹皮多糖、靈芝多糖、白術(shù)多糖及青錢柳多糖等［23-26］選用不同截留分子量的超濾膜可以實(shí)現(xiàn)多糖的分級，獲得不同分子量段的多糖。截留范圍更低的納濾膜則可用于低聚糖的精制和分離，如六味地黃方藥液活性多糖［27］的分離。膜分離代替柱層析法對混合多糖按照分子量進(jìn)行分離具有明顯的優(yōu)點(diǎn):一是膜分離設(shè)備簡單，能耗低，在良性使用環(huán)境下，可以連續(xù)使用，并保持較好的分離效果;二是不損壞多糖的活性，分離過程不引入化學(xué)試劑，對多糖本身無污染。然而，活性多糖屬于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子化合物，有黏性，在膜分離過程中加重濃差極化和膜污染等造成的膜滲透通量下降，更易產(chǎn)生膜污染和堵塞，在實(shí)際應(yīng)用中其分離提純難度較大，此為膜分離應(yīng)用必須解決的關(guān)鍵問題［28-30］。

此外，利用分子大小差異的分離方法還有基于多糖在超速離心的條件下沉積比率不同的規(guī)律而得以分離的超速離心法，雖然該方法對多糖本身的破壞小，分離效果好，但是儀器要求高，操作困難。

2.1.2 分步沉淀和鹽析純化法

分步沉淀通常指根據(jù)不同分子量多糖在不同濃度乙醇溶液中的溶解度不同，依此增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來的分離過程。分步沉淀實(shí)際上可視為一種同時(shí)利用分子量大小和溶解度差異的分離過程。該分離方法在多糖的研究中使用最為廣泛，同時(shí)，利用該方法還可以脫除一些脂溶性的色素等雜質(zhì)［31，32］。

鹽析是另一種常見的利用溶解度差異的分離方法，根據(jù)不同多糖在不同濃度鹽溶液中具有不同溶解度的性質(zhì)，加入不同鹽析劑使不同多糖逐步析出。該方法也屬于分步沉淀，不同之處在于該法使用的是不同濃度的鹽溶液而非醇溶液，該法通常僅限于酸性多糖的分離。常用的鹽有 NaCl、KCl、(NH4)2SO4，其中以(NH4)2SO4最佳［33］。

2.2 層析(色譜)分離法

在天然產(chǎn)物的分離純化研究中，柱層析是常見的分離純化方法，多糖純化所使用的柱層析固定相有別于其他諸如黃酮、蒽醌、萜類等小分子成分，根據(jù)目標(biāo)物的理化性質(zhì)，選擇最合適的固定相和流動(dòng)相以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的高效分離純化。在多糖的柱層析分離純化中常見的固定相有纖維素、DEAE-纖維素、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、親和葡聚糖凝膠等。根據(jù)待分離多糖與使用的固定相填料之間的作用力不同可將柱層析分為纖維素柱層析、離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和柱層析，其中離子交換柱層析和凝膠柱層析應(yīng)用最為廣泛［34-41］。

纖維素柱層析法適于分離各種酸性多糖和中性多糖，在多糖的除色素中也常常使用［42］。純化時(shí)常選用不同濃度的洗脫液階段洗脫，首先是小分子被洗脫，然后是大分子的多糖。此法效果好，多糖純度高，溶劑消耗量大，但分離耗時(shí)，尤其分離粘性多糖時(shí)易粘附流速更慢。離子交換柱層析是目前多糖純化中應(yīng)用最廣的一種方法，適合于分離各種酸性、中性粘多糖，如帶負(fù)電荷的多糖可在陰離子型DEAEcellulose 柱或DEAE-Sephadex柱上達(dá)到分級［43］。特別是對于體積較大的多糖，大多采取陰離子交換柱層析純化，甚至可以分離到均一組分，如穿龍薯蕷粗多糖［2］、巴豆多糖［44］、白樺茸水溶性多糖［45］、白毛藤多糖［46］、四角蛤蜊多糖［47］及龍眼多糖［48］。使用較為普遍的交換劑有DEAE-纖維素(DEAE-cellulose)、DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)和DEAE-瓊脂糖(DEAE-Sepharose)。凝膠柱層析是目前植物多糖最常用的純化方法，實(shí)際上起分子篩作用，不同質(zhì)量的多糖按分子量從大到小的順序被洗脫出來，達(dá)到純化的目的。其優(yōu)點(diǎn)是簡單、條件溫和、快速，但不適宜粘多糖的分離。親和層析需要將具有一定結(jié)構(gòu)的親和分子制成固定相吸附劑來對被分離物質(zhì)進(jìn)行吸附分離，因此具有特定結(jié)構(gòu)的親和分子“配基”顯得尤為重要，由于植物多糖的復(fù)雜性，有些粘性多糖的粘性大，容易在層析柱上產(chǎn)生吸附，配基的選擇也比較困難，因此這種層析方法的應(yīng)用不是很多。

2.3 化學(xué)沉淀法

多糖作為一類大分子物質(zhì)，在某些多糖的長鏈結(jié)構(gòu)中可能會包含一些特殊取代基或基團(tuán)如羧基、硫酸基等，使這些多糖具有特殊的化學(xué)性質(zhì)，利用這些特性使多糖發(fā)生簡單的化學(xué)反應(yīng)并從溶劑中沉淀出來以實(shí)現(xiàn)多糖的有效分離。

長鏈季銨鹽能與酸性多糖成鹽形成水不溶性多糖季銨鹽，以分離酸性及中性多糖的季銨鹽沉淀法即為常見的化學(xué)沉淀法之一。在季銨鹽沉淀法中，酸性強(qiáng)或分子量大的酸性多糖首先沉淀出來，控制季銨鹽的濃度，也能分離各種不同的酸性多糖。常用的季銨鹽是十六烷基三甲基銨的溴化物(CTAB)及其堿(CTA-OH)和十六烷基吡啶(CPC)，如張銳等［49］對柚子皮果膠多糖提取時(shí)運(yùn)用十二烷基伯胺乙酸鹽鹽析法。

金屬絡(luò)合法則是另一種較為常見的用于多糖分離的方法，其分離過程是根據(jù)某些多糖能與金屬離子如銅、鋇、鈣和鉛等形成配合物而沉淀，將配合物沉淀充分洗滌后，用無機(jī)酸乙醇液或硫化氫處理，重新獲得游離的多糖。常用的絡(luò)合劑有含有Cu2+的斐林試劑、CuCl2、Ba(OH)2等。這一類基于簡單化學(xué)反應(yīng)的分離方法在分離化學(xué)性質(zhì)差異明顯的多糖時(shí)效果顯著，但分離過程中需要嚴(yán)格控制反應(yīng)程度，避免多糖結(jié)構(gòu)的不可逆改變而影響其生理活性。

2.4 其他純化方法

電泳法(制備型區(qū)域電泳)也可用于酸性多糖的分離、鑒定或提純，其分離效果較好。但目前電泳技術(shù)應(yīng)用于多糖研究存在缺陷，在多糖領(lǐng)域的應(yīng)用上多是用來鑒定純度，用于多糖分離時(shí)時(shí)間較長，分離量少［50］。

綜上所述，中藥多糖的純化技術(shù)較多，利用多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行物理的及化學(xué)的純化方法，各純化方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，文中將各種純化技術(shù)總結(jié)匯總于表2。從各分離純化方法的相關(guān)應(yīng)用中可以看到，在對多糖實(shí)際樣本進(jìn)行純化時(shí)往往不是上述幾種方法的簡單應(yīng)用，一種方法往往不能一次性地獲得均一性的多糖組分，只有綜合利用幾種方法才能達(dá)到理想的純化效果。多糖的純化應(yīng)根據(jù)不同種類中藥材的性質(zhì)選擇合適的純化方法，盡量避免一種純化方法劣勢的同時(shí)充分聯(lián)合應(yīng)用兩種或多種純化方法。

表2 植物多糖的分離純化方法比較表Table 2 Comparison of purification methods for polysaccharides from natural plants

3 總結(jié)及展望

隨著人們對糖類的認(rèn)識不再局限于能源和細(xì)胞結(jié)構(gòu)材料，研究者們對多糖研究的無限可能充滿期待。多糖所蘊(yùn)藏的結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了核酸或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，一方面使其成為最有魅力的信息載體，另一方面也給我們的研究帶來了巨大的困難，包括結(jié)構(gòu)解析、構(gòu)效關(guān)系等。但所有的研究難點(diǎn)都需要一個(gè)突破口——即采用高效的提取、分離純化手段從天然產(chǎn)物中有效獲取結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、化學(xué)組成、聚合度均一的多糖。盡管本文對近年來多種提取及純化方法被用于中藥多糖成分的提取分離純化進(jìn)行了介紹，但由于多糖的復(fù)雜性，選擇合適的方法得到具有較好均一性的多糖仍然是多糖研究領(lǐng)域的難題。未來天然多糖研究中，可根據(jù)不同來源、不同類別的多糖，兼顧其生物活性，建立起與之相應(yīng)的一種高效穩(wěn)定的分離純化方法，避免在其后續(xù)的結(jié)構(gòu)和生物活性研究中因分離純化的差異而導(dǎo)致的不確定性。

1 Finkelstein J.Glycochemistry and glycobiology.Nature，2007，446:999.

2 Luo DH.Structural investigation of a polysaccharide(DMB)purified from Dioscorea nipponica Makino.Carbo Poly，2014，103:261-266.

3 Wang KP，et al.Structural differences and conformational characterization offive bioactive polysaccharides from Lentinus edodes.Food Res Int，2014，62:223-232.

4 Heng ZC，et al.Water-soluble polysaccharides from finger citron fruits(Citrus medica L.var.sarcodactylis).Carbo Res，2014，388:100-104.

5 Kratchanova M，et al.The effect of microwaveheating of fresh orange peels tissue and quality of extracted pectin.Carbo poly，2004，56:181-185.

6 Chen M(陳叢瑾)，et al.Study on the hot water extraction process of polysaccharide from Toona sinensis(A.Juss.)Roem.leaves assisted by microwave pretreatment.Food Sci Technol(食品科技)，2010，35:178-182.

7 Wu YF(吳艷芳)，et al.Study on microwave-assisted extraction of polysaccharides from Corni Fructus.Hubei Agric Sci(湖北農(nóng)業(yè)科學(xué))，2011，50:570-572.

8 Chen ZG，et al.Purification，preliminary characterization and in vitro immunomodulatory activity of Tiger lily polysaccharide.Carbo Poly，2014，106:217-222.

9 Huang HW，et al.Advances in the extraction of natural ingredients by high pressure extraction technology.Trends Food Sci Technol，2013，33:54-62.

10 Jing SQ(敬思群)，et al.Optimization of the technology condition of ultra-high pressure on extraction polysaccharides from Coreopsis basalis.Food Sci Technol(食品科技)，2013，38:168-172.

11 Chen RZ，et al.Ultrahigh pressure extraction of polysaccharides from Cordyceps militaris and evaluation of antioxidant activity.Sep Purific Technol，2014，134:90-99.

12 Chen HG，et al.Optimization of enzyme assisted extraction of polysaccharides from Astragalus membranaceus.Carbo Poly，2014，111:567-575.

13 You QH，et al.Enzyme assisted extraction of polysaccharides from the fruit of Cornus officinalis.Carbo Poly，2013，98:607-610.

14 Han RS(韓榮生)，et al.Study of the extraction technical conditions of Angelica polysaccharide.World J Integ Tradit Western Med(世界中西醫(yī)結(jié)合雜志)，2011，6:234-237.

15 Chen LH(陳莉華)，et al.Extraction and purification of polysaccharides from Hong Guo Ginseng and the comparison of antioxidant activity.Nat Prod Res Dev(天然藥物研究與開發(fā))，2012，25:170-173.

16 Xu Y(徐艷)，et al.Extract Astragalus polysaccharides by ultrasonic cell disrupter.Chin J Inf TCM(中國中醫(yī)藥信息雜志)，2007，14(3):44-45.

17 Peng YF，et al.Structure and antitumor activities of the water-soluble polysaccharides from Ganoderma tsugae mycelium.Carbo Poly，2005，59:385-392.

18 Sahena F，et al.Application of supercritical CO2in lipid extraction-A review.J Food Eng，2009，95:240-253.

19 Chen J，et al.Supercritical CO2extraction and pre-column derivatization of polysaccharides from Artemisia sphaerocephala Krasch.Seeds via gas chromatography.Indus Crops Prod，2014，60:138-143.

20 Liu Y(劉楊)，et al.Extraction of spirulina platensis polysaccharide by ethanol/(NH)2SO4.Chem Res Appl(化學(xué)研究與應(yīng)用)，2012，24:1781-1785.

21 Xu HJ(徐海軍)，et al.Extraction of lentinan by aqueous two-phase system.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，25:982-985.

22 Han YP(韓永萍)，et al.Research on inorganic ceramic micro-filtration membrane treating with rough Cordyceps mycelia polysaccharides solution.Food Ferment Ind(食品與發(fā)酵工業(yè))，2008，34(2):90-93.

23 Wang ZY(王子堯)，et al.Study on separation of polysaccharides from moutan cortex by ultrafiltration technique.Mem Sci Technol(膜科學(xué)與技術(shù))，2009，29:99-100.

24 Yang ZJ(楊祖金)，et al.Purification of Ganoderma lucidum polysaccharide by ultrafiltration technology.J Chin Med Mater(中藥材)，2009，32:126-129.

25 Zhou JR(周家容)，et al.Isolation of Atractylodes macrocephala Koidz polysaccharides with ultrafiltration membrane and study of their antioxidant activity.J Southwest Univ，Nat Sci Ed(西南大學(xué)學(xué)報(bào))，2009，31(4):79-82.

26 Jian HX，et al.Separation of water-soluble polysaccharides from Cyclocarya paliurus by ultrafiltration process.Carbo Poly，2014，101:479-483.

27 Zhong L(鐘蕾)，et al.Effect analysis of the concentration of Liuwei Dihuang polysaccharides by the membrane separation technique and the traditional method.J Pharm Prac(藥學(xué)實(shí)踐雜志)，2007，25:386-388.

28 Alain M，et al.Extraction and fractionation of polysaccharides and B-phycoerythrin from the microalga Porphyridium cruentum by membrane technology.Algal Res，2014，5:258-263.

29 Mi JZ(米吉造).Studies on Application of Membrane separation technology production of Vitamin C.Tianjin:Tianjin University(天津大學(xué))，MSc.2003.

30 Enrico D，et al.Membrane engineering in process intensification—An overview.J Mem Sci，2011，380:1-8.

31 Wu Z，et al.Extraction optimization，preliminary characterization，and in vitro antioxidant activities of crude polysaccharides from finger citron.Ind Crops Prod，2013，44:145-151.

32 Wang D，et al.Characterization of a water-soluble polysaccharide from Boletus edulis and its antitumor and immunomodulatory activities on renal cancer in mice.Carbo Poly，2014，105:127-134.

33 Sun WY(孫文怡)，et al.Optimization of purification technique conditions of fruiting body polysaccharide of H.caputmedusae(Bull.Fr.)Pets.using salting-out method.J Jilin Norm Univ，Nat Sci(吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2011，3:88-91.

34 Tang W(湯偉)，et al.Study on purification of polysaccharides in root of Salviam iltiorrhizaby macroporous adsorption resin and ion-exchange resin methods.J Chin Med Mater(中藥材)，2010，33:1937-1941.

35 Xie MY(謝明勇)，et al.A Review about the research of structure and function of polysaccharides from natural products.J Chin Insti Food Sci Technol(中國食品學(xué)報(bào))，2010，10(2):1-11.

36 Zhao H，et al.Purification，characterization and immunomodulatory effects of Plantago depressa polysaccharides.Carbo Poly，2014，112:63-72.

37 Chi AP，et al.Morphological and structural characterization of a polysaccharide from Gynostemma pentaphyllum Makino and its anti-exercise fatigue activity.Carbo Poly，2008，74:868-874.

38 Sanya H，et al.Water-soluble polysaccharides with pharmaceutical importance from Durian rinds(Durio zibethinus Murr.):isolation，fractionation and bioactivities.Carbo Poly，2004，56:471-481.

39 Zhou R(周銳)，et al.Purification and hepatoprotective effect of Momordica polysaccharides.Food Sci Technol(食品科技)，2013，38:173-176.

40 Fang JN(方積年)，et al.Bioactivities，isolation and purification methods of polysaccharide.Chin J Nat Med(中國天然藥物)，2007，5:338-347.

41 Halina L，et al.Affinity chromatography for the purification of lectins(a review).J Chromatogr A，1981，215:361-372.

42 Shen J(沈潔)，et al.Research progress in extraction，chemical modification and anticancer activity of fungi polysaccharides.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2014，26:1723-1727.

43 Zhang L，et al.Purification，antioxidant and immunological activities of polysaccharides from Actinidia Chinensis roots.Inter J Bio Macro，2015，72:975-983.

44 Begona M，et al.Characterization of a fucoarabinogalactan，the main polysaccharide from the Gum Exudate of Croton urucurana.J Nat Prod，2002，65:1143-1146.

45 Fan LP，et al.Antitumor and immunomodulatory activity of water-soluble polysaccharide from Inonotus obliques.Carbo Poly，2012，90:870-874.

46 Mao JS(毛建山)，et al.Isolation，purification，and identification of polysaccharide of Solanum lyratum.Chin Trad Herb Drugs(中草藥)，2005，36:654-656.

47 Ling CW，et al.Isolation and structural elucidation of novel homogenous polysaccharide from Mactra veneriformis.Carbo Poly，2011，86:982-987.

48 Zhang MW，et al.A method of separation of neutral polysaccharide from longyan(一種中性龍眼多糖級分的分離方法).CN 201010603686.5，2010-12-24.

49 Zhang R(張銳)，et al.Extraction of polysaccharides from grapefruit peel by salting-out with dodecylamine acetate salt.Sci Tech Food Ind(食品工業(yè)科技)，2006，27:120-122.

50 Zheng ZH(鄭震寰)，et al.Studies on the electrophoreticmethods of acidic polysaccharide from Spirulina plantensis.Pharm Biol(藥物生物技術(shù))，2004，11:104-107.