微生物中抗耐藥菌活性天然產(chǎn)物的研究進展

褚福鑫，白志強，朱紅惠*

1 廣東省微生物研究所省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣州 510070;2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510000

微生物廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境中，其次級代謝產(chǎn)物種類多樣、結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特［1，2］。據(jù)不完全統(tǒng)計，從微生物中發(fā)現(xiàn)的活性天然產(chǎn)物已達22500 種之多，應(yīng)用于臨床的微生物藥物有150 余種［3］。因此，從微生物中尋找藥物先導(dǎo)化合物是目前創(chuàng)新藥物研究最活躍的領(lǐng)域之一［4，5］。

抗生素是臨床上用于抗感染治療的主要藥物［6］。然而伴隨其廣泛使用，耐藥性病原菌不斷出現(xiàn)，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、耐青霉素肺炎鏈球菌(Penicillin-resistant Streptococcus pneumonia，PRSP)、耐萬古霉素腸球菌(Vancomycin-resistant Enterococcus，VRE)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)產(chǎn)生菌和多藥耐藥性結(jié)核桿菌等［7，8］。耐藥性的提高降低了抗菌藥物的效果，導(dǎo)致患病率、死亡率和醫(yī)藥費用的增加，已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的主要威脅［9，10］。新型抗耐藥菌抗生素類藥物的開發(fā)已迫在眉睫［11］。目前，抗菌藥物的研究已從針對各種普通細菌轉(zhuǎn)向耐藥細菌［12，13］。

1 抗耐藥菌活性天然產(chǎn)物的篩選方法

近年來細菌耐藥性問題不斷加劇，而傳統(tǒng)的抗生素篩選方法效率低下，已不能滿足醫(yī)療衛(wèi)生的需要，急需新的高效的篩選方法［14］。

1.1 隨機篩選

隨機篩選是最傳統(tǒng)的方法，又稱為抗生素產(chǎn)生菌與活性物質(zhì)的雙重篩選。經(jīng)典流程是:從采集的樣品中分離出菌株，并對每一菌株進行發(fā)酵，然后用發(fā)酵液或粗提物進行抗菌活性初篩，抗菌活性的檢測以常見的細菌及耐藥菌為指示菌，如MRSA、VRE、PRSP 等。初篩以后要進行復(fù)篩，以確定其對病原生物的實際效果［15］。

1.2 定向篩選

1.2.1 篩選模型

目前，已有許多篩選模型應(yīng)用到初篩中，實現(xiàn)了定向篩選。如郭長偉等建立了萬古霉素耐藥菌模型，成功篩選出SIPI-2001-542 等4 株抗耐藥菌陽性菌株，并從中分離出高效抗耐藥菌化合物SIPI-2001-542 等［16］。

1.2.2 抗生素合成基因簇

隨著微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成機制研究的不斷深入，已證實微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因具有呈簇排列特征，即與特定產(chǎn)物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、耐藥性基因和轉(zhuǎn)運蛋白基因等集中位于染色體的一段連續(xù)區(qū)域［17］。目前，已有大量抗生素合成基因簇被分析研究，如聚酮類化合物合成酶(PKS)生物合成基因簇，梅嶺霉素生物合成簇等［18，19］。

結(jié)合已知的抗生素合成基因簇，可以運用宏基因組學(xué)技術(shù)在樣品中直接定向篩選特定類型抗生素的合成菌，也可以采用特異性引物和PCR 技術(shù)從大量微生物中快速確定具有合成某類化學(xué)結(jié)構(gòu)次級代謝產(chǎn)物潛力的菌株［20，21］。

1.2.3 抗菌靶點

圖1 化合物1～3 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1～3

數(shù)以百計的細菌關(guān)鍵蛋白被確定為抗菌藥物的潛在靶點，然而只有少數(shù)作為臨床藥物的有效靶點。這些靶點包括:青霉素結(jié)合蛋白，D-Ala-D-Ala 連接酶，MruA，十一異戊烯焦磷酸酶，細胞壁上的丙氨酸消旋酶，30S 和50S 核糖體蛋白，延伸因子G，參與蛋白質(zhì)合成的Ile-tRNA 合成酶，參與RNA 合成的RNA 聚合酶，參與脂肪酸合成的InhA(FabI)，參與細胞代謝的二氫葉酸還原酶(FolA)和p-氨基苯甲酸合成酶，參與DNA 合成的DNA 促旋酶和撲拓異構(gòu)酶IV［22］。最近還有一些新的抗菌靶點陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如合成細菌活性關(guān)鍵物質(zhì)lipidA 所必須的鋅依賴脫乙酰酶LpxC，革蘭氏陽性(Gram Positive，G+)菌表面的蛋白質(zhì)錨定酶Sortase 等［23，24］。

針對一種新靶點抑制劑的篩選方法分為兩種［25］。一種是經(jīng)驗型篩選，即采用活細胞建立篩選模型，然后探討其作用機理，并在此基礎(chǔ)上根據(jù)需要進行化學(xué)修飾，以降低毒性、提高藥效。這種方法能確保藥物的生物活性，但這種方法會篩選出許多選擇性差，毒性強的化合物。另一種則完全脫離生物體，以化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，直接測定可能對靶標有作用的系列化合物的活性。這種方法效率更高，但是還需要大量的后續(xù)工作去驗證篩得的化合物在細胞內(nèi)是否能夠發(fā)揮良好的作用。

簡述幾種針對靶點的新篩選方法:

1.2.3.1 雙平板敏感性差異實驗(Agar-diffusion two-plate differential sensitivity assay)

通過反義RNA 等途徑抑制靶點蛋白表達作為缺陷組，無靶點蛋白抑制作為對照組，分別接種兩塊平板。再通過杯碟法測定抑菌圈，抑菌圈大小即反映了抗生素最小抑菌濃度(Minimal inhibition concentration，MIC)水平。如果化合物對靶點有抑制活性，則對照組抑菌圈較缺陷組顯著變大;否則對照組和缺陷組抑菌圈無顯著性差異。運用此方法，Katherine Young 等從250000 種天然化合物中篩選出全新的FabH/FabF 抑制劑Phomallenics［22，26］。Phomallenics 是一類新的真菌產(chǎn)物，包括A、B、C(1～3，圖1)三種化合物，都有抗MRSA、流感嗜血桿菌和枯草芽孢桿菌活性。其中Phomallenic C 的抗耐藥菌效果最好(MIC=3.9，3.9，15.6 μg/mL)，Phomallenic B 活性次之(MIC=12.5、7.8、31.3 μg/mL)。

1.2.3.2 計算機輔助藥物設(shè)計(Computer Aided Drug Design，CADD)

CADD 是利用計算化學(xué)基本原理，通過模擬受體生物大分子與藥物的相互作用或通過分析藥物結(jié)構(gòu)與活性內(nèi)在關(guān)系，合理篩選、設(shè)計新型先導(dǎo)化合物的藥物設(shè)計方法，主要又包括虛擬篩選和藥效團設(shè)計兩個方法［27，28］。虛擬篩選是基于小分子數(shù)據(jù)庫開展的活性化合物篩選，主要包括分子對接、藥效團篩選和片段搜索等方法，高效快速的在天然化合物中挖掘先導(dǎo)化合物，是發(fā)現(xiàn)藥物靶點作用的最有效的方法。藥效團設(shè)計可以針對篩得化合物進行優(yōu)化，提高活性、減少毒性，加快藥物研發(fā)進程。

1.2.3.3 抗菌靶點模型篩選

對抗菌靶點蛋白進行體外克隆表達、分離純化、分析和活性檢測，并在此基礎(chǔ)上借助合理方法，展開抗菌物質(zhì)的篩選。董國霞等對抗菌靶點E.faecium PDF 進行了克隆表達、分離純化，對獲得的純度較高的目的蛋白進行Western blotting 分析和活性檢測，并以之為靶點建立篩選模型，然后運用高通量篩選方法，對20261 個微生物發(fā)酵樣品進行了篩選。最終發(fā)現(xiàn)I03A-00723 和I03A-05772 的發(fā)酵產(chǎn)物對多種耐藥G+菌如MRSA、MRSE、E.faecalis HH22 和VRE 等有抗菌活性，另外菌株I06A-01113 的發(fā)酵產(chǎn)物對VRE 有抗菌活性但不抗MRSA［29］。

2 抗耐藥菌活性天然產(chǎn)物研究進展

2.1 甾體和萜類

圖2 化合物4～14 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of compounds 4～14

Wen 等從紅樹林瓶花木Scyphiphora hydrophyllacea 中的一株內(nèi)生真菌中分離出四種新單萜類化合物Guignardones F-I 和兩種已知化合物Guignardones A and B［30］。其中Guignardone I(4，圖2，下同)抗MRSA 活性明顯，抑菌圈為11 mm;Guignardone B(5)抗MRSA 活性較弱，抑菌圈為8 mm。Domonkos Fehér 等報道從源于卡內(nèi)奧赫灣海蛞蝓的交替假單胞菌菌株(Pseudoalteromonas sp.)CMMED 290 中分離到的多溴代物2，3，5，7-tetrabromobenzofuro［3，2-b］pyrrole(6)和4，4＇，6-tribromo-2，2＇-bipheno(7)對MRSA 的IC50分別為1.93 和2.19 μM(萬古霉素的IC50為0.91 μM)［31］。Liu 等從來源于水母內(nèi)部組織的Paecilomyces variotii 中分離到四種聚酮化合物，其中三個(8～10)對MRSA(MIC 分別為＞40，20，40 μg/mL)及多重耐藥副溶血性弧菌(MIC＞40 μg/mL)都有一定的抗菌活性［32］。Ling等報道，廈門紅樹林中分離到的內(nèi)生菌Streptomyces sp.HKI0595 能產(chǎn)生新的吲哚倍半萜類化物Xiamycin B(11)、Indosespene(12)和Sespenine(13)及已知化合物Xiamycin A(14)，對包括MRSA 和VRE在內(nèi)的多種細菌有抑制活性［33］。其中Xiamycin A和Indosespene 對包括多重耐藥菌株在內(nèi)的多種革蘭氏陰性(Gram Negatine，G-)和G+菌株都有抗菌活性。

2.2 黃酮類和醌類化合物

江等報道在土壤中分離的鏈霉菌SIPI-434 能生產(chǎn)抗耐藥菌活性物質(zhì)Genistein(金雀異黃素)(15，圖3，下同)［34］。在市場上有以Genistein 為主原料的保健品，該文首次發(fā)現(xiàn)并報道其有抗MRSA 活性。

Schneemann 等在源于波羅的海海綿中的鏈霉菌(Streptomyces sp.)HB202 中分離出Mayamycin(16)［35，36］，其對MRSA 活性明顯(IC50=1.25 μM)，對肺炎桿菌、痤瘡丙酸桿菌等在內(nèi)的8 株菌株也有活性(IC50=2.5～8.4 μM)，另外對HepG2，HT-29等8 種人腫瘤細胞(IC50=0.13～0.33 μmol/L)和鼠成纖維細胞NIH-3T3(IC50=0.22 μmol/L)都有細胞毒活性。Socha 等在海洋鏈霉菌屬Streptomyces 菌株N1-78-1 中分離出BE-43472 A-D(17～20)［37，38］。日本學(xué)者早在十年前就已分離得到這些化合物，但只作為抗癌物質(zhì)研究［39］。Socha 等發(fā)現(xiàn)，BE-43472 A-D 不僅對HCT-116 有細胞毒性，抗MRSA 和VRE活性同樣明顯。又以BE-43472 B 活性最好，對MRSA 和VRE 的MIC 為0.11-0.45 μM，對MRSA 臨床株和VRE 臨床株的MIC 分別為0.91～3.6 μM，29 μM。(+)-BE-43472B 的非天然對映異構(gòu)體(-)-BE-43472B 有著相似的活性。Mercado 等從鏈霉菌新屬新種CNQ-525 中分離出三種新的、及兩種已經(jīng)報道過的chlorine-containing terpenoid dihydroquinones［40］。其中三種Chlorinated dihydroquinones 1，3，4(21～23)抗MRSA(MIC 分別為1.95、1.95、1.90μg/mL)和 VRE(MIC 分別為3.90、1.95、3.90μg/mL)活性明顯。黃等從海洋放線菌佛州小單孢菌利福霉素亞種(Micromonospora floridensis subsp.rifamycetica)菌株AM105 的發(fā)酵液中分離到活性成分AM105-II，被鑒定為安莎霉素類抗生素利福霉素，這是佛州小單胞菌產(chǎn)生利福霉素的首例報道［41］。AM105-II 由Rifamyein S(24)和其異構(gòu)體Isorifamyein S(25)兩種化合物構(gòu)成，其中Isorifamyein S 為新結(jié)構(gòu)化合物。在抑菌試驗中，AM105-II 抗MRSA(MIC=0.03～0.25 μg/mL)活性明顯，對其它幾種G+、G-菌活性同樣明顯，且活性較臨床藥物Riafmyein SV 更好。

Platencin(26)和Platensimycin(27)是由默克公司研究人員最近發(fā)現(xiàn)的抗耐藥菌天然化合物［42，43］。其中Platencin 從西班牙馬略卡島收集的Streptomyces platensis MA7339 中提取出，Platensimycin 則從南非收集的同種細菌MA7327 中分離到。它們的抗耐藥菌活性明顯，作用菌株包括MRSA(MIC=0.5 μg/mL)、VRE(MIC=0.1 μg/mL)、耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus，VRSA)(MIC=0.1 μg/mL)、耐利奈唑胺和耐大環(huán)內(nèi)脂類抗生素病原菌等多種耐藥菌。Platencin和Platensimycin 細胞毒性低，作用機制獨特，與傳統(tǒng)抗生素不存在交叉耐藥性。Sunga 等從海洋放線菌類菌株NPS8920 中分離出一類具有獨特抗生素活性的新2-亞烷基-4-惡唑烷酮化合物，共包含Lipoxazolidinones A，B，C(28～30)三種化合物［44，45］。其中Lipoxazolidinone A 的抗MRSA 和VRE 活性最好(MICs=1～2 μg/mL)。在篩選抑制細菌脂肪酸生物合成物質(zhì)的研究中，Singh 等在假單胞菌(Pseudomonas sp.)F92S91 中篩選出對MRSA，VRE及其它一些細菌有抗菌活性的親脂性α-吡喹酮化合物α-Pyrone I(31)，II(32)及其衍生物Furanone III(33)［46］。它們的抗MRSA 活性明顯(MIC 分別為4，16，16μg/mL)，又以α-Pyrone I 抗MRSA 和VRE 活性最好(MIC 分別為2～4 μg/mL 和2～64 μg/mL)。

Süssmuth 等 通 過 對 para-aminobenzoic acid(pABA)靶點的篩選，從日本海沉積物樣品中分離到菌株Verrucosispora AB-18-032，并分離出Abyssomicin B，C(34)，D，G，H，及Abyssomicin C 異構(gòu)體atrop-Abyssomicin C(35)［47，48］。后Niu 等又從陸生菌株Streptomyces sp.HKI0381 中分離到Abyssomicin E［49］。Abyssomicin C 抗MRSA 和VRSA 活性明顯(MIC=4-13 μg/mL)，其異構(gòu)體atrop-Abyssomicin C抗MRSA 活性更好［50］。Cueto 等報道從海洋真菌Pestalotia sp.CNL-365 和另一株海洋耐藥細菌CNJ-328 的混合培養(yǎng)物中分離到一種新的氯化苯甲酮抗生素Pestalone(36)［51，52］。該化合物只有在二者共同培養(yǎng)時才會產(chǎn)生。Pestalone 抗MRSA(MIC=37 ng/mL)和VRE(MIC=78 ng/mL)活性明顯。Kuimoto 等從日本土壤中分離到的Amycolatopsis sp.菌株ML630-mFI 中分離出新的抗菌化合物Kigamicin A～E(37～41)［53］。Kigamicins 對一些G+菌抗菌活性明顯，且對MRSA 的MIC 均在0.10～0.78 μg/mL內(nèi)，并以Kigamicin A 活性最好;同時Kigamicin D 對各種小鼠腫瘤細胞均有很好的活性。Banskota 等報道通過基因分析，從萬古霉素生產(chǎn)菌東方擬無枝菌酸菌(Amycolatopsis orientalis)ATCC 43491 的發(fā)酵液中分離到新的糖苷聚酮類化合物 ECO-0501(42)［54］。ECO-0501 對多種G+菌活性明顯，特別是對MRSA(4 μg/mL)和VRE(8～16 μg/mL)，同萬古霉素的活性相似。

2.3 生物堿類化合物

McArthur 等報道從Marinispora sp.NPS12745 菌株的發(fā)酵液中分離出鹵化雙吲哚吡咯化合物L(fēng)ynamicins A～E(43～47，圖4，下同)［55］。它們對MRSA、VRE 和VSE 均有一定的活性。其中Lynamicins A-D 活性明顯，對MRSA、VRE 和VSE 的MIC分別在1～3，2～8，1.5～8 μg/mL 的范圍內(nèi);又以Lynamicins B 活性最好，對這三種菌的MIC 分別達到1、2、1.5 μg/mL。

圖3 化合物15～42 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of compounds 15～42

甘等報道在云南省雙柏縣倉房河的土壤中分離到鏈霉菌IO8A1776 能生產(chǎn)水溶性活性成分鏈絲菌素E［Streptothricin E(48)］［56］。鏈絲菌素是首次利用親水作用色譜分離純化微生物發(fā)酵液中的水溶性活性化合物得到的。鏈絲菌素E 對多種G+、G-菌抗菌活性明顯，同時還有明顯的體外抗耐藥結(jié)核分枝桿菌活性(MIC=0.25～1 μg/mL)。Phillips 等報道在源于中非共和國森林土壤的新屬Kibdelosporangium 的菌株發(fā)酵液中分離出全新結(jié)構(gòu)的抗生素Kibdelomycin［57，58］。Kibdelomycin(49)是一種細菌II 型拓撲異構(gòu)酶抑制劑，對G+菌活性顯著，對耐甲氧西林、新生霉素、庫馬霉素、環(huán)丙沙星金黃色葡萄球菌MIC 值分別為0.5、0.5、4、0.5 μg/mL;同時對G-菌也有一定的活性。Hughes 等從源于海洋沉積物的海洋鏈霉菌新種Streptomyces sp.(CNQ-418)的發(fā)酵液中分離出Marinopyrroles A(50)and B(51)，而又經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化，得到Marinopyrroles C(52)～F［59-61］。Marinopyrroles A、B、C 抗MRSA 活性明顯(MIC90 分別為0.31、0.63、0.16 μg/mL)，同時對人類癌細胞(HCT-116)有細胞毒性，Marinopyrroles A非天然結(jié)構(gòu)(+)-Marinopyrrole A 抗MRSA 活性同樣明顯(MIC=0.31 μM)。Jung 等從源于韓國海洋淤泥樣品的Streptomyces 菌株AM045 的發(fā)酵液中分離出Actinomyccetes，其抗MRSA 活性比萬古霉素和替考拉寧要好［62］。該化合物后被證實為放線菌素V(Actinomycin V)(53)。

和田霉素(Hetiamacin)是劉等從源于塔克拉瑪干沙漠的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PJS 中分離得到的一類新型抗耐藥菌化合物［63，64］。其中，Hetiamacin A(54)和Hetiamacin B(55)為Amicoumacin類新抗生素，抗耐藥菌活性明顯。尤其是Hetiamacin A，對耐苯唑西林葡萄球菌如金黃色葡萄球菌(ORSA/MRAS)和表皮葡萄球菌均有強體外抗菌活性(MIC=1～2 μg/mL);且其細胞毒性較低，有望成為新抗MRSA 感染先導(dǎo)化合物。Furumai 等從海洋放線菌Streptomyces platensis TP-A0598 中分離出抗MRSA 活性(MIC=3～13 μg/mL)產(chǎn)物TPU-00370-A～D(57～60)［65］。這些化合物結(jié)構(gòu)與從土樣中得到的Streptomyces lydicus 培養(yǎng)物中分離出的已知抗生素Lydicamycin(56)極其相似，Lydicamycin抗MRSA 的MIC 為6 μg/mL［66，67］。Sherman 等從海洋沉積物分離到的類似鏈霉菌菌株Streptomyces sp.307-9 的發(fā)酵液中分離出具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的四種化合物TirandamycinA～D(61～64)，它們對VRE 的MIC 分別為2.25、100、110 和＞9 μmol/L［68］。

圖4 化合物43～64 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structures of compounds 43～64

2.4 多肽類化合物

達托霉素(Daptomycin，圖5，下同)(65)是由玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)發(fā)酵衍生的一種酸性酯肽類抗生素，2003 年經(jīng)FDA 批準上市，對包括MRSA 和VRE 的G+菌抗菌活性明顯［69，70］。達托霉素能引起細菌胞內(nèi)鉀離子外流，改變細胞膜電位，阻斷DNA、RNA 及蛋白質(zhì)合成。達巴萬星(Dalbavancin)(66)是一種濃度依賴性的抗G+菌糖肽類抗生素，2014 年經(jīng)FDA 批準上市，是替考拉寧類似糖肽(A-40926)的半合成衍生物［71，72］。達巴萬星的先導(dǎo)化合物A-40926 從野野村放線菌屬菌株Nonomuraea sp.ATCC 39727 的發(fā)酵液中分離出，該化合物不僅能夠有效抑制萬古霉素敏感菌，且對萬古霉素中敏金黃色葡萄球菌、VRSA、vanB VRE 等萬古霉素耐藥菌同樣顯示出較強的抗菌活性［73］。達巴萬星能夠抑制細菌細胞壁的合成，抗MRSA 活性(MIC50=0.06 mg/L)與萬古霉素(MIC50=1 mg/L)、替考拉寧(MIC50=0.5 mg/L)相比大大提高，同時對PRSP 和耐青霉素化膿性鏈球菌抗菌活性同樣明顯(MIC50≤0.06 mg/L)，且具有優(yōu)秀的臨床安全性［72，74，75］。奧利萬星(Oritavancin，LY333328)(67)是在第一代糖肽抗生素萬古霉素的基礎(chǔ)上開發(fā)的第二代糖肽抗生素，是Amycolatopsis Orientalis 發(fā)酵產(chǎn)生的LY264826 的衍生物，2014 年經(jīng)FDA 批準上市，用于治療G+菌引起的感染［76］。該抗生素能抑制細菌細胞壁的形成，作用機制同萬古霉素相似［77］。Patel 等報道了該抗生素對臨床分離的35 株VRE、33 株MRSA 和29 株P(guān)RSP 的MIC 分別為為2 mg/L、1 mg/L 和＜0.1125 mg/L;其抗MRSA、VRE活性較萬古霉素、替考拉寧、奎奴普丁/達福普汀等抗生素更顯著［78-80］。

李子強等人在游動放線菌(Actinpplanes sp.)PDF-1 中分離到諾西肽(Nosiheptide)(68)［81］。諾西肽有抗G+球菌活性，特別是對MRSA(MIC＜0.004 μg/mL)和VRE(MIC=0.004～0.015 μg/mL)抗菌活性明顯。李益等篩選出能分泌抗MRSA活性物質(zhì)環(huán)(L-纈-L-脯)二肽(69)和環(huán)(L-異亮-L-脯)二肽(70)的海洋放線菌Micromonospora sp.(No.69)［82］。近年來，環(huán)二肽相繼被報道具有介導(dǎo)細胞間通訊、抗菌和抗腫瘤等作用，此報道首次發(fā)現(xiàn)了環(huán)二肽的抗MRSA 作用［83］。Andersen 研究組在新幾內(nèi)亞的海洋蠕蟲組織中分離到桿狀細菌MKPNG-276A，培養(yǎng)后分離到單環(huán)狀多肽Loloatin B(72)［84］。抑菌試驗顯示Loloatin B 抗MRSA、VRE及PRSP(MIC=1～2 μg/L)活性突出。該研究組后續(xù)分離到Loloatin A(71)、C(73)、D(74)，loloatin A～D 對上述3 種耐藥菌的體外抑菌試驗MIC 平均分別為4、2、0.5、8 μg/mL，可見Loloatin C 抗菌活性最好［85-87］。

Singh 等 在 從 Amycolatopsis fastidiosa ATCC 202099 的提取物中分離到一系列噻唑基多肽類化合物［88］。其中Thiazomycin E2(75)、Thiazomycin C(76)和Thiazomycin D(77)對MRSA 菌株MB5395(MIC 分別為0.02、0.05、0.031 μg/mL)，VRE 菌株CL5791(MIC 分別為0.004、0.1、0.01 μg/mL)抗菌活性明顯。該類化合物抗菌作用方式異于常用抗菌藥物，其活性不易受病原體耐藥性的影響，值得研究和開發(fā)。Sun 等報道從源于斐濟海洋沉積物的Streptomyces sp.CNS-575 中分離出新縮肽類化合物Fijimycins A～C 和已知化合物Etamycin A［89］。其中Fijimycins A(78)、C(79)及Etamycin A(80)抗MRSA 活性明顯，對臨床及社區(qū)分離的MRSA 抗菌活性明顯(MIC100=4～32 μg/mL)。Engelhardt 等從源于挪威特隆赫姆海灣樣品的一株擬諾卡氏菌(Nocardiopsis sp.)TFS65-07 中分離出環(huán)肽化合物TP-1161(81)［90，91］。經(jīng)試驗證實，TP-1161 對多種耐萬古霉素的G+菌抗菌作用突出(MIC=0.25～1.0 μg/mL)。Andersen 等從熱帶珊瑚礁棲息地收集的細菌Bacillus sp.中分離到新型多肽類抗生素Bogorol A(82)［92］，其對人源MRSA(MIC=2 μg/mL)和VRE(MIC=10 μg/mL)抗菌活性明顯;對大腸埃希氏菌有中等的抗菌活性(MIC=35 μg/mL)。該化合物揭示了一個“陽離子多肽抗生素”的全新結(jié)構(gòu)模板。郭等報道通過萬古霉素耐藥菌模型篩選出微黃鏈霉菌(S.flavesens)菌株SIPI-2001-542，并分離出SIPI-2001-542(83)［16］。SIPI-2001-542 對萬古霉素耐藥菌458V20 及MRSA 菌株9913 和9914 的抗菌活性(MIC 分別為0.25、0.25、0.25 mg/L)比萬古霉素(MIC 分別為＞6.25、1.56、1.56 mg/L)和替考拉寧(MIC 分別為0.78、3.13、3.13 mg/L)好。另外也首次報道了放線菌素D 對耐藥G+菌的抑菌活性。李等報道在土壤中篩選分離的鏈霉菌菌株SIPI-1140 能合成抗耐藥菌活性化合物Quinomycins［93］，此次共分離出兩種有效化合物QuinomycinA(84)和Quinomycin C(85)，它們是已經(jīng)報道過的抗腫瘤抗生素，此次報道了其優(yōu)良的抗MRSA 活性。

多粘類芽孢桿菌是少數(shù)能夠產(chǎn)生具有臨床應(yīng)用價值抗生素的細菌［94］。Octapeptin B5、B7 是在錢等從其發(fā)現(xiàn)的Paenibacillus 屬新種菌株F6-B70 中分離出的新多粘菌素類脂肽類抗生素，屬于Octapeptin家族新成員［95］。Octapeptin B5、B7 對G+、G-菌均有較好的抗菌活性，特別是Octapeptin B5，具有抗菌活性好、產(chǎn)量高的特點，被命名為八肽菌素(battacin)(86)［96］。在錢等的研究中，八肽菌素對所有測試過的G-菌均具有顯著的抗菌作用(MIC=2～16 μg/mL)，包括銅綠假單胞菌、大腸桿菌及17 株臨床分離株。這些臨床分離菌株中有47%是多重耐藥菌，其中23%是對所有測試過的臨床常用抗生素耐藥的超級耐藥菌。另外，八肽菌素對G-桿菌的MIC/MBC 均同目前已在上市的多粘菌素B 相當，且安全性要更好，暗示了這類化合物的應(yīng)用潛力。Nocathiacins 是從諾卡菌屬(Nocardia sp.)菌株ATCC 202099 的發(fā)酵液中分離出，包括Nocathiacin I、II、III(87～89)及Nocathiacin I 衍生物BMS-461996(90)和BMS-411886(91)［97，98］。Nocathiacins 抗G+菌活性明顯，主要通過粘附于細菌23S rRNA 上，阻止細菌蛋白質(zhì)的合成。特別是Nocathiacin I 及其衍生物BMS-461996 和BMS-411886，對耐藥菌株MRSA(MIC 分別為0.007、0.007、0.06 μg/mL)，VRE(MIC 分別為0.03、0.015、0.03 μg/mL)，PRSP(MIC分別為0.0005、0.015、0.003 μg/mL)活性均突出，且比萬古霉素(抗MRSA、VRE、PRSP 的MIC 分別為0.06、0.03、0.003 μg/mL)要好。

2.5 大環(huán)內(nèi)脂類化合物

泰利菌素(Telithromycin)(92，圖6，下同)是首個上市的第三代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素_酮內(nèi)酯類藥物，也是半合成的大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺-鏈陽霉素B 家族中第一個藥物，于2001 年上市［99，100］。該抗生素通過直接與細菌核糖體50S 亞基結(jié)合，阻礙細菌蛋白質(zhì)的合成。泰利菌素抗菌譜廣泛，不僅對包括肺炎鏈球菌、肺炎球菌、嗜血流感桿菌、莫拉漢菌等在內(nèi)的G+、G-菌有明顯的活性，同樣對MRSA、PRSP 以及大環(huán)內(nèi)脂耐藥菌等多重耐藥菌臨床活性顯著［101-103］。喹紅霉素(Cethromycin)(93)是一種新的廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其作用機制同泰利菌素大致相同，且毒性小、抗菌譜更廣，目前正處于III 期臨床階段［104，105］。喹紅霉素對耐藥的呼吸道致病菌如肺炎鏈球菌、黏膜炎莫拉菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體和嗜肺軍團菌等均有很強的抗菌活性。Igarashi 等從土壤中收集的諾卡氏菌(Nocardia sp.)MK703-102F1 中分離到含有反式十氫化萘骨架的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合Tubelactomicin A(94)［106］。Tubelactomicin A 對耐巴龍霉素、卡那霉素和鏈霉素的結(jié)核分枝桿菌ATCC607 菌株抗菌活性良好(MIC=0.1 μg/mL)。Kwon 等從源于加州拉荷亞海洋沉積物的海洋放線菌新種Marinispora CNQ-140 的發(fā)酵液中分離出多烯多元醇化合物Marinomycins A～D(95～98)［107］。Marinomycin A 抗耐藥菌的活性最強，對MRSA 和VRE 抗菌活性突出(MIC 均為0.13 μM)，而Marinomycin B、C、D 僅對MRSA 有活性(MIC 均為0.25 μM)。Ling 等從紅樹林中分離到內(nèi)生菌Streptomyces sp.HKI0576 可以代謝產(chǎn)生新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物Divergolides A～D(99～102)［108］。Divergolides A、B、D 對MRSA 有抗菌活性(每孔50 μg 時，抑菌圈直徑11～19 mm)，Divergolides C 對VRE 同樣有活性(每孔50 μg 時，抑菌圈直徑14 mm)，另外這四種化合物對枯草芽孢桿菌和牡牛分枝桿菌均有活性(每孔50 μg 時，抑菌圈直徑10～19 mm)。Okujo 等從源于馬來西亞土壤的Microbispora sp.菌株A34030 的發(fā)酵液中分離出一系列大環(huán)內(nèi)酯類化合物Bispolides［109］。Bispolides 共包含Bispolide A1、A2、A3、B1、B2a、B2b 和B3(103～109)七種化合物，這些化合物均對臨床分離的MRSA 活性明顯(MIC=1～4 μg/mL)。

2.6 其他

奎奴普丁(110，圖7，下同)/達福普汀(111)是從鏈霉菌(Streptomyces)中分離到的鏈陽霉素類已上市抗生素，是普那霉素(Pristinamycin)兩個組分的半合成衍生物，統(tǒng)稱為Synercid［110，111］。Synercid 作用于細菌核糖體，抑制蛋白質(zhì)的合成，對大多數(shù)多重耐藥G+菌抗菌活性良好［112］。Synercid 對鏈球菌(包括青霉素敏感和青霉素耐藥鏈球菌)的MIC 為0.125～1 mg/L，同時對金黃色葡萄球菌(甲氧西林敏感和甲氧西林耐藥)和屎腸球菌(萬古霉素敏感和萬古霉素耐藥)的MIC 均小于1 mg/L［113］。隨后，RPR-106972 作為RPR-106950(112)和RPR-112808(113)的55∶45 的混合物被篩選出，結(jié)構(gòu)較Synercid 簡單，但抗耐藥菌活性更顯著［114］。替加環(huán)素(Tigecycline)(114)是一種新型的甘氨酰四環(huán)素類新抗生素，2005 年經(jīng)FDA 批準上市，對眾多致病菌包括G+菌，需氧、厭氧G-菌及擬桿菌活性明顯，對綠膿桿菌無活性，對陽性吲哚變形桿菌和奇異變形桿菌的活性也很低［115，116］。替加環(huán)素對包括MRSA、VRE、PRSP 的高度耐藥菌，都有明顯活性［117］。

圖5 天然產(chǎn)物65～91 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structures of compounds 65～91

矯等從其發(fā)現(xiàn)的海洋鏈霉菌新種星海鏈霉菌中分離出新型亞砜類抗耐藥菌活性物質(zhì)星海霉素(Xinhaiamine)［118］。亞砜類化合物普遍具有廣譜抗菌、殺蟲和抗腫瘤活性。此文是首次在微生物中分離出亞砜類化合物的報道。Xinhaiamine A(115)和B 都對S.auresu、B.subtilis、E.coli、A.baumanii 和P.earuginosa 抗菌活性明顯(Xinhaiamine A 的MIC 分別為0.69、0.35、0.17、2.76 和11.04 μM;Xinhaiamine B 的MIC 分別為0.35、0.17、0.17、5.52 和11.04 μM)，它們對臨床MRSA 分離株也顯示出一定的抑菌活性(MIC 分別為2.76～5.52 μM 和5.52 μM)，但效果均不如萬古霉素。Istamycin(116)是從一株海洋放線菌中分離得到的新型氨基糖苷類抗生素［119］。Istamycin 對G+、G-細菌，特別是對耐氨基糖苷類細菌活性極強(MIC=0.1～3.0 μg/mL)，很可能成為臨床應(yīng)用的抗感染藥物。Kintana 等報道從源于海泥的假單胞菌Pseudomonas sp.CB-104 的發(fā)酵液中分離到含硫七元化合物Thiotropocin(117)［120］。Thiotropocin 對耐藥G+、G-菌均有抗菌活性，對植物病原體和支原體也有抑制活性(MIC=0.78～12.5 μg/mL)。Doshida 等報道從源于海綿mycale adhaerens 的 Exophiala pisciphila 菌 株NI10102 的培養(yǎng)液中分離到β-羥基飽和長脂肪鏈化合物Exophilin A(118)［121］。Exophilin A 能有效抑制G+菌的生長，對糞鏈球菌的MIC 為12.5 μg/mL，對MRSA 的MIC 為50 μg/mL。

圖6 天然產(chǎn)物92～109 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 Chemical structures of compounds 92～109

Singh 等從源于南非納馬夸蘭土壤樣品的游動放線菌(Actinoplanes philippinensis)菌株MA7347 中提取到新的噻唑肽苷化合物Philipimycin(119)［122］。Philipimycin 對MRSA 菌株MB5393 抗菌活性良好(MIC=0.125 μg/mL)，且同樣可以抑制萬古霉素、利奈唑酮和大環(huán)內(nèi)酯類化合物耐藥的糞大腸桿菌群(MIC=0.03 μg/mL)。Asolkar 等報道從分離自大巴哈馬群島的海鞘中的居沙鹽孢菌(Salinispora arenicola)CNR-647 中篩選出一種新糖苷類化合物Arenimycin(120)［123］。Arenimycin 抗MRSA 活性突出，對耐利平和甲氧西林金黃色葡萄球菌的MIC=1.06 μg/mL，對其他MRSA 菌株的MIC 在0.05～1.03 μg/mL 范圍內(nèi)，同時抗其它G+致病菌和分支桿菌的活性也很好(MIC=0.05～1.0 μg/mL)。Isnansetyo 等報道從一株紅藻Ceratodiction spongiosum表面分離到一株P(guān)seudomonas sp.(strain AMSN)，該菌株產(chǎn)生的2，4-Diacetylphloroglucinol(DAGP)(121)顯示出抗MRSA、VRSA 和VRE 活性(MIC=1～8 μg/mL)［124，125］。DAGP 活性穩(wěn)定，可在70 ℃下以及pH 2～7 的條件下保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，且細胞毒性較低。Shiozawa 等從海洋細菌Alteromonas rava SANK 73390 中分離到含硫代謝物Thiomarinols A～G(122～128)［126-129］。Thiomarinols 作用方式為抑制異亮氨酰轉(zhuǎn)移RNA 合成酶，抗菌譜廣，對G+、G-菌均有活性，特別是對G+菌及MRSA 活性顯著(MIC≤0.01 μg/mL)。Isnansetyo 等又在海洋細菌Pseudoalteromonas phenolica O-BC30T中分離出MC21-A(129)和MC21-B(130)［130，131］。它們的抗MRSA 活性(MICs=1～4 μg/mL)同萬古霉素(MIC=0.25～2 μg/mL)相似。MC21-A 同樣對腸球菌、屎腸球菌和糞腸球菌活性明顯。MC21-A 對人細胞沒有細胞毒性，MC21-B 對人細胞有細胞毒性。Kanoh 等報道從帕勞共和國硬珊瑚中分離到的Zygosporium sp.KNC52 能 產(chǎn) 生Sulfoalkylresorcinol(131)［132］。Sulfoalkylresorcinol 對MRSA 抗菌活性明顯(MIC=12.5 μg/mL)，同時對Mycobcterium tuberculosis(MDRTB)，M.bovis BCG、M.avium、Pseudomonas aeruginosa(MDRP)都存在一定活性。

圖7 天然產(chǎn)物110～131 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.7 Chemical structures of compounds 110～131

3 討論

放線菌是公認的第一大藥源微生物類群，本文列舉的新型抗耐藥菌化合物同樣主要源于放線菌［133］。在過去五十年中，從陸生放線菌中共收獲了100，000 種化合物，這其中囊括了70%的天然抗生素［3］。研究表明，放線菌仍是新活性物質(zhì)的最主要生產(chǎn)菌，在新抗生素開發(fā)中地位依然十分重要［3，134］。

另一方面，雖然陸生菌來源的抗生素對人類健康做出了巨大貢獻，然而隨著細菌抗耐藥性的不斷增加和陸生菌資源的日漸枯竭，陸生菌來源的抗生素已不能滿足人類健康的需要［135］。海洋微生物種類豐富，生存環(huán)境特殊，產(chǎn)生化合物種類繁多、結(jié)構(gòu)新穎，且開發(fā)程度尚低［136，137］。因此，海洋微生物已成為人類尋找、開發(fā)新型抗生素的重點和熱點［136，138］。本文中提到的新型抗耐藥菌化合物中，很多源自海洋。

目前，新型抗耐藥菌化合物的篩選多針對MRSA、VRE 在內(nèi)的G+性耐藥菌［139］。然而隨著細菌耐藥性的不斷適應(yīng)和進化，G-菌耐藥性及危害性也趨嚴重［140，141］。2011 年臨床分離的耐藥菌中，G-菌占71.5%，種類多樣且抗藥性突出［142］。泛耐藥G-桿菌的出現(xiàn)和不斷增多，已成為全世界臨床面臨的另一重大挑戰(zhàn)［143，144］。因此，篩選針對G-菌，特別是產(chǎn)ESBLs 及泛耐藥的G-菌的抗生素，同樣要引起高度重視。

隨著樣品來源的不斷豐富，對抗菌化合物篩選技術(shù)的不斷提高，以及對活性化合物分析的不斷深入，人類必定能夠不斷篩選出高效安全的新型抗生素，從而解決細菌耐藥性帶來的巨大威脅，保證人類的健康生存。

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