黃花棘豆生物堿成分研究

譚承建，劉麗娜，湯洪敏，石本鈺，冉堅(jiān)強(qiáng)，趙寶玉

1 貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025;2貴陽醫(yī)學(xué)院生物與工程學(xué)院，貴陽 550004;3 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100

黃花棘豆(Oxytropis ochrocephala Bunge)，俗名馬絆腸，是豆科棘豆屬多年生草本植物［1］，為危害我國天然草原畜牧業(yè)的一種重要毒害草，主要分布在我國青海、寧夏、甘肅、四川、西藏等省區(qū)的的天然草場，覆蓋面積多達(dá)200 余萬畝。本地馬、牛、綿羊、山羊等牲畜對黃花棘豆有一定的辨識(shí)能力，一般不會(huì)采食，但在可食牧草缺乏的地方或季節(jié)，牲畜被迫采食黃花棘豆而引起中毒發(fā)生，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡，危害當(dāng)?shù)夭菰竽翗I(yè)［2］。

對于黃花棘豆化學(xué)成分的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有黃酮、三萜、生物堿類成分［3，4］，對其毒性部位-生物堿的研究最為活躍。前人已經(jīng)分離出以苦馬豆素為代表的吲哚里西啶生物堿［5］，和臭豆堿、黃華堿、羽扇豆堿和鷹爪豆堿4 個(gè)喹諾里西啶生物堿［6］。喹諾里西啶生物堿是豆科植物廣泛存在的一類代謝產(chǎn)物，具有重要的化學(xué)生態(tài)學(xué)功能。此外，研究報(bào)道該類生物堿具有諸如平喘、抗心律失常、抗?jié)?、抗病毒、抗炎、抗菌等藥理活性?］，作為其重要代表的氧化苦參堿，已經(jīng)被用于乙肝病毒的臨床治療［8］。黃花棘豆在天然退化草原生長旺盛，資源豐富。因此，在不破壞草原生態(tài)的前提下，開展黃花棘豆生物堿成分的研究，為其資源合理利用奠定基礎(chǔ)就具有重要意義。本試驗(yàn)對黃花棘豆生物堿成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，從中分離到8 個(gè)生物堿成分，分別鑒定為:槐定堿(Sophoridine，1)、槐胺(Sophoramine，2)、異槐定堿(Isosophoridine，3)、苦參堿(Matrine，4)、7，11-去氫苦參堿(7，11-Dehydromatrine，5)、槐果堿(Sophocarpine，6)、羽扇豆堿(Lupanine，7)和苦馬豆素(Swainsonine，8)。

1 儀器與材料

Bruker AM-400 型核磁共振儀，F(xiàn)innigan MAT 90型質(zhì)譜儀，Agilent 1100 型高效液相色譜儀(DAD 檢測器)，柱色譜硅膠(200～300、300～400 目)及薄層板GF254均為青島海洋化工廠生產(chǎn)，Sephadex LH-20為Amersham Biosciences 公司產(chǎn)品。

黃花棘豆植物樣品，2012 年8 月采自青海省湟中縣，由青海大學(xué)莫重輝教授鑒定為黃花棘豆(Oxytropis ochrocephala Bunge)，憑證標(biāo)本(ZhaoBY-201203)，保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院有毒植物研究所。

2 提取與分離

黃花棘豆全株10 kg，粉碎后用95%乙醇40 L熱回流提取3 次，每次2 h，提取液減壓濃縮后得到浸膏2 kg。捻溶于6 L 沸水中，用2 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)水溶液pH1～3，氯仿萃取3 次，每次7 L。酸水液再用2 mol/L NaOH 的溶液調(diào)節(jié)至pH10～11，用氯仿萃取3 次，每次8 L。回收氯仿得到總生物堿50 g?？偵飰A用硅膠柱層析進(jìn)行粗分，氯仿-甲醇系統(tǒng)(10∶0～0∶10)梯度洗脫，得到5 個(gè)部分(Frs.A～E)。其中Fr.B(10.6 g)經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 分離純化得化合物1(2 g)、2(50 mg)和3(16 mg);Fr.C(9.7 g)經(jīng)Sephadex LH-20，半制備HPLC分離純化得化合物4(16 mg)和5(12 mg);Fr.D(12.5 g)經(jīng)Sephadex LH-20，硅膠柱層析分離得化合物6(35 mg)和7(18 mg);Fr.E(6 g)經(jīng)硅膠柱層析分離，重結(jié)晶得化合物8(48 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無色針狀結(jié)晶(丙酮)。ESI-MS 顯示準(zhǔn)分子離子峰為m/z 249［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:3.20～3.42(3H，m，H-11，H2-17)，2.72～2.82(2H，m，H-2a，10a)，2.20(3H，m，H2-14，H-6)，2.14(2H，m，H-2b，10b)，2.00(2H，m，H-3a，5)，1.86(2H，m，H-4a，12a)，1.60～0.90(10H，m);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:169.9(C-15)，63.2(C-6)，55.8(C-2)，55.6(C-11)，50.2(C-10)，47.4(C-17)，40.9(C-7)，32.4(C-14)，30.7(C-5)，30.1(C-12)，28.1(C-4)，23.6(C-3)，21.7(C-8)，21.4(C-9)，18.9(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［9］，故化合物1 鑒定為槐定堿。

化合物2 無色結(jié)晶(丙酮)。ESI-MS 顯示準(zhǔn)分子離子峰為m/z 245［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.28(1H，m，H-13)，6.43(1H，d，J=8.8 Hz，H-14)，6.23(1H，d，J=7.2 Hz，H-12)，4.18(1H，dd，J=14.8，6.8 Hz，H-17a)，3.81(1H，m，H-6)，2.90(1H，t，J=12.9 Hz，H-17b)，2.80(2H，m，H-2a，H-10a)，2.32(1H，m，H-6)，2.21– 1.47(14H，m);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:163.8(C-15)，148.0(C-11)，138.3(C-13)，116.3(C-14)，103.2(C-12)，60.3(C-6)，56.7(C-2)，56.4(C-10)，43.5(C-17)，38.4(C-7)，32.0(C-5)，27.9(C-8)，26.9(C-4)，21.1(C-9)，20.3(C-3)。碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［10］，故該化合物鑒定為槐胺。

化合物3 無色晶體(丙酮)。ESI-MS m/z 249［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.56(1H，dd，J=11.2，4.5 Hz，H-17a)，3.03～2.93(5H，m)，2.45-1.01(18H，m);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:170.1(C-15)，61.6(C-6)，59.8(C-11)，53.3(C-10)，46.2(C-17)，44.3(C-2)，35.7(C-5)，33.1(C-7)，32.0(C-14)，27.1(C-12)，25.8(C-8)，24.9(C-3)，22.2(C-4)，18.6(C-9)，18.2(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［11］，故化合物3 鑒定為異槐定堿。

化合物4:無色晶體(氯仿)。ESI-MS 顯示準(zhǔn)分子離子峰為m/z 249［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.31(1H，dd，J=12.7，4.1Hz，H-17a)，3.83(1H，m，H-11)，3.00(1H，t，J=11.7 Hz，H-17b)，2.89(2H，m，H-2a，H-10a)，2.34～2.03(7H，m)，1.95～1.35(14H，m);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:172.9(C-15)，63.0(C-6)，58.3(C-2)，58.2(C-10)，54.7(C-11)，44.5(C-17)，42.8(C-7)，36.8(C-5)，33.4(C-14)，28.7(C-12)，28.0(C-4)，27.2(C-8)，22.1(C-3)，21.6(C-9)，19.6(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［12］，故化合物4 鑒定為苦參堿。

化合物5 無色針狀結(jié)晶(丙酮)。ESI-MS 顯示準(zhǔn)分子離子峰為m/z 247［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.25(1H，m，H-17a)，3.31(1H，m，H-17b);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:170.6(C-15)，135.8(C-11)，109.0(C-7)，61.7(C-6)，58.2(C-10)，56.5(C-2)，41.6(C-17)，33.2(C-14)，33.0(C-5)，29.6(C-12)，28.0(C-4)，27.5(C-8)，25.4(C-9)，22.2(C-3)，20.8(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［9］，故化合物5鑒定為7，11-去氫苦參堿。

化合物6 無色晶體(乙醚)。ESI-MS 顯示準(zhǔn)分子離子峰為m/z 247［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.62(1H，m，H-13)，5.65(1H，dt，J=9.0，1.9 Hz，H-14)，4.00(1H，dd，J=12.9，4.7 Hz，H-17α)，3.90(1H，m，H-11)，3.14(1H，t，J=12.9 Hz，H-17b)，2.78(2H，m，H-2a，H-10a)，2.59(1H，m，H-6)，2.31～1.47(16H，m);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:167.3(C-15)，141.4(C-13)，123.8(C-14)，64.3(C-6)，57.8(C-10)，57.5(C-2)，52.5(C-11)，42.6(C-17)，41.9(C-7)，35.6(C-5)，28.4(C-4)，28.0(C-12)，26.8(C-8)，22.0(C-3)，21.2(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［11］，故化合物6 鑒定為槐果堿。

化合物7 白色固體。ESI-MS 顯示準(zhǔn)分子離子峰為249［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.39(lH，dd，J=12.6，4.5 Hz，H-17b)，3.84(IH，m，H-9)，3.64(lH，m，H-11)，3.03(lH，m，H-10b)，2.98(lH，t，J=12.6 Hz，H-17a)，2.83(lH，d，J=10.3 Hz，H-2)，2.43(lH，t，J=16.9，4.4 Hz，H-14b)，2.25(lH，m，H-14a)，1.83(lH，t，J=10.3 Hz，H-10a)，1.31(lH，dd，J=12.3，4.7 Hz，H-8);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:171.3(C-15)，63.9(C-11)，60.8(C-6)，55.4(C-15)，52.9(C-17)，44.8(C-7)，46.7(C-10)，34.8(C-7)，33.6(C-12)，33.0(C-3)，32.3(C-9)，27.3(C-8)，26.7(C-5)，25.3(C-14)，24.4(C-13)，19.6(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［13］，故化合物7 鑒定為羽扇豆堿。

化合物8 無色針晶(甲醇)。ESI-MS 顯示準(zhǔn)分子離子峰為m/z 174［M+H］+。1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ:4.58(1H，dd，J=6.0，4.0 Hz，H-1)，4.42(1H，t，J=6.5 Hz，H-2)，3.24(1H，d，J=9.5 Hz，H-3a)，2.41(1H，dd，J=9.8，7.0 Hz，H-3b)，2.90(1H，d，J=10.4 Hz，H-5a)，1.87(1H，d，J=10.9 Hz，H-5b)，1.67(1H，qt，J=13.0，3.9 Hz，H-6a)，1.57(1H，dt，J=12.5，4.0，H-6b)，1.49(1H，qd，J=12.1，3.6 Hz，H-7a)，2.25(1H，dd，J=12.8，3.5 Hz，H-7b)，4.40(1H，dd，J=9.9，4.6 Hz，H-8)，1.99(1H，dd，J=8.0，4.5 Hz，H-8a);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:75.5(C-8a)，70.6(C-1)，69.5(C-2)，66.7(C-8)，63.3(C-3)，52.4(C-5)，34.8(C-7)，24.7(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［14］，故化合物8 鑒定為苦馬豆素。

4 討論

前人從黃花棘豆中分離得到臭豆堿、黃華堿、羽扇豆堿、鷹爪豆堿和苦馬豆素5 個(gè)生物堿［5，6］，而本次試驗(yàn)從青海采集的黃花棘豆也分離到羽扇豆堿和苦馬豆素。除此之外，還得到了6 個(gè)苦參堿類似物，為第一次從黃花棘豆中發(fā)現(xiàn)這一系列生物堿。從生源角度上講，羽扇豆型和苦參堿型生物堿生物合成前體都為賴氨酸，只是成環(huán)過程中稠合方式不一樣［15，16］，由此，也不難理解兩種骨架類型的喹諾里西啶生物堿共存于黃花棘豆植株之中。

苦參堿及其類似物的應(yīng)用由來已久，不僅作為醫(yī)藥用途如“復(fù)方苦參注射液”，也用作生物農(nóng)藥如“苦參堿水劑”等，其主要源于從豆科槐屬植物苦參(Sophora flavescens Ait)中分離提取。本次研究證實(shí)棘豆屬植物黃花棘豆也含有苦參堿類似物，具有重要的藥用資源學(xué)意義。研究資料表明，從該植物中分離得到的另外一種吲哚里西啶生物堿-苦馬豆素是強(qiáng)的α-甘露糖酶抑制劑，具有抗癌和免疫增強(qiáng)等生物活性［17］，并作為一個(gè)抗腫瘤候選藥物進(jìn)入到臨床實(shí)驗(yàn)［18］。此外，以槐定堿(2 g)為先導(dǎo)化合物，我們成功得到一個(gè)具有顯著抗癌活性的化學(xué)分子(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。以上的研究結(jié)果為草原有毒植物-黃花棘豆的有效利用奠定了良好的基礎(chǔ)。近年來，由于過度放牧、亂采亂挖、氣候等人為和自然因素，導(dǎo)致天然草原生態(tài)環(huán)境和生物多樣性破壞嚴(yán)重，黃花棘豆大量生長，許多地方已經(jīng)成為優(yōu)勢種群。如果能在不破壞當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的前提下進(jìn)行合理、適度的利用與開發(fā)，不僅能促進(jìn)人類健康，還可加速當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展。

1 Academia Sinica(中國科學(xué)院).Botany of China(中國植物志).Beijing:Science Press，1998.42(2)，21.

2 Lu H，Wang SS，Zhou QW，et al.Damage and control of major poisonous plants in the western grasslands of China-a review.Rangel J，2012，34:609-615.

3 Li X，Zhang SD，Jin HZ，et al.A new flavonol from Oxytropis ochrocephala Bunge.Nat Prod Res，2013，27:554-557.

4 Sun RQ，Jia ZJ，Cheng DL，et al.Four saponins from Oxytropis ochrocephala.Planta Med，1992，58:211-213.

5 Cao GR(曹光榮)，Li SJ(李紹居)，Duan DX(段得賢)，et al.The isolation and identification of toxic components from Oxytropis ochrocephala.J Northwest Sci-Tech Univ Agric Forest(西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，1989，17:1-7.

6 Meng XZ(孟協(xié)中)，Hu XQ(胡向群)，Zhang RM(張如明)，et al.The isolation and identification of toxic alkaloids from Yellowflower Crazyweed(Oxytropis ochrocephala).Chin Tradit Herb Drug(中草藥)，1994，25:61-64.

7 Wang LS，You YJ，Wang SQ，et al.Synthesis，characterization and in vitro anti-tumor activities of matrine derivatives.Bioorg Med Chem Lett，2012，22:4100-4102.

8 Gao LM，Han YX，Wang YP，et al.Design and synthesis of oxymatrine analogues overcoming drug resistance in hepatitis B virus through targeting host heat stress cognate 70.J Med Chem，2011，54:869-876.

9 Wang L，Wu XD，He J，et al.A new quinolizidine alkaloid from Sophora flavescens.Chem Nat Comp，2014，50:876-879.

10 Galasso V，Asaro F，Berti F，et al.On the molecular and electronic structure of matrine-type alkaloids.Chem Physics，2006，330:457-468.

11 Xiao P，Li JS，Saito K，et al.(─)-14β-hydroxymatrine，a new lupine alkaloid from the roots of sophora tonkinensis.Chem Pharm Bull，1996，44:1951-1953.

12 Ling JY，Zhang GY，Cui ZJ，et al.Supercritical fluid extraction of quinolizidine alkaloids from Sophora flavescens Ait.And purification by high-speed counter-current chromatography.J Chromatogr A，2007，1145:123-127.

13 Przybyl AK，Kubicki，M.Simple and highly efficient preparation and characterization of(-)-lupanine and(+)-sparteine.Tetrahedron，2011，67:7787-7793.

14 Zhao PY，Liu ZY，Wang JJ，et al.Isolation and NMR study on swainsonine from locoweed，Astragalus Strictus.Agric Sci China，2009，8:115-120.

15 Negrete R，Cassels BK，Eckhardt G.(+)-9α-hydroxymatrine from Sophora macrocarpa.Phytochemistry，1983，22:2069-2072.

16 Xiao P，Kubo H，Komiya H，et al.Lupin alkaloids from seeds of Sophora Viciifolia.Phytochemistry，1999，50:189-193.

17 Sott DW，Black LL，Vallejo MO，et al.Increased sensitivity of Apolipoprotein E knockout mice swainsonine dependent immunomodulation.Immunobiology，2014，219:497-502.

18 Goss PE，Reid CL，Bailey D，et al.Phase IB clinical trial of the oligosaccharide processing inhibitor swainsonine in patients with advanced malignancies.Clin Cancer Res，1997，3:1077-1086.