擬康氏木霉菌YIM PH30002 鐵載體活性化學(xué)成分

陳金蓮，劉 凱，苗翠萍，官會(huì)林，趙立興*，孫世中*

1 云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，昆明 650092;2云南大學(xué)省微生物研究所 教育部微生物多樣性可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650091

木霉菌屬絲孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)木霉屬(Trichoderma)真菌，是典型的絲狀真菌，具有較強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)能力，易于生長(zhǎng)繁殖，在各種環(huán)境中有著廣泛的分布與種群有優(yōu)勢(shì)，尤其在森林與農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境中極易分離得到［1］。木霉菌具有重寄生、分泌胞外酶降解病原真菌細(xì)胞壁、產(chǎn)生抑菌活性次生代謝產(chǎn)物等生物學(xué)特性，木霉菌作為生物防治菌劑在全球農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用已取得矚目的成效［2］。

微生物產(chǎn)生的具有鐵離子螯合活性的次生代謝產(chǎn)物即鐵載體(siderophores)對(duì)依賴鐵離子的病原菌有顯著抑制作用［3］，鐵載體通路已成為抑制病原菌的潛在新靶標(biāo)。Vinale 等［4］人從哈茨木霉(Trichoderma harzianum)代謝產(chǎn)物中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)對(duì)馬鈴薯具有促生作用的新型鐵載體化合物harzianic acid。自然環(huán)境中許多微生物具有產(chǎn)生鐵載體成分的能力，其具體功能與作用已獲得了階段性的闡釋［5］，微生物鐵載體活性成分的研究對(duì)藥物研發(fā)與農(nóng)業(yè)種植有著重要意義。

擬康氏木霉Trichoderma koningiopsis YIMPH 30002 分離自健康三七(Panax notoginseng)植物，通過雙層瓊脂平板法與發(fā)酵粗提物的鐵載體活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在PDB 培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出對(duì)鐵離子較強(qiáng)的螯合活性。從其發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物中分離得到5 個(gè)聚酮類化合物，經(jīng)波譜解析分別鑒定為:konginginin A(1)、konginginin B(2)、konginginin D(3)、konginginin F(4)、konginginin M(5)。對(duì)單體化合物進(jìn)行了抑菌與鐵載體活性分析，化合物均無明顯抑菌活性，但化合物2 的鐵離子螯合活性相對(duì)較強(qiáng)。

1 儀器與材料

1.1 菌株來源

菌株YIM PH30002 分離于三七植物的莖部，綜合其ITS 基因序列(GenBank 登錄號(hào):KM 190127)系統(tǒng)發(fā)育分析與形態(tài)學(xué)特征觀察結(jié)果，確定為擬康氏木霉菌(Trichoderma koningiopsis YIM PH30002)。標(biāo)本菌株保存于云南大學(xué)省微生物研究所菌種保藏庫(kù)。

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200.0，葡萄糖15.0，瓊脂12.0，蒸餾水，液體培養(yǎng)基(PDB)不加瓊脂。改良馬丁培養(yǎng)基(g/L):K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，蔗糖10.0，蛋白胨5.0，酵母浸膏2.0，瓊脂12.0，蒸餾水，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。察氏培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30.0，NaNO32.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，瓊脂12.0，蒸餾水，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。LB 培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0，蒸餾水，pH 7.2-7.4。

1.3 主要儀器與試劑

柱色譜硅膠(200～300 目)和GF254薄層色譜硅膠板均由青島海洋化工有限責(zé)任公司生產(chǎn);Sephadex LH-20 為瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司生產(chǎn);MCI gel(75～150 μm)為英國(guó)Hichrom 公司生產(chǎn);分析型與半制備型HPLC 為安捷倫1200 Series，色譜柱為Phenomenex C18(250 mm×4.60 mm，5 μm)與YMC C18(250 mm×10 mm，5 μm)柱;核磁共振波譜由Bruker AV-400 和DRX-500 測(cè)定，TMS(四甲基硅烷)為內(nèi)標(biāo);質(zhì)譜分析由Agilent G3250AA spectrometer 質(zhì)譜儀測(cè)定;顯色方法為熒光燈下波長(zhǎng)254 nm 和365 nm 處觀察熒光，碘蒸氣顯色與硫酸茴香醛處理后加熱顯色;分析純?cè)噭┦兔?，乙酸乙酯，丙酮，氯仿，甲醇由天津化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);色譜純甲醇由德國(guó)Merck 公司生產(chǎn);鐵載體活性檢測(cè)試劑CAS 溶液:首先將60.5 mg 鉻天青S(Chrome azurol S，CAS)，溶解于50 mL 去離子水中，加入10 mL Fe3+溶液(1 mM FeCl3·6H2O，10 mM HCl)混勻后，記為“A 液”;其次稱取72.9 mg 十六氨基烷基溴化銨(HTDMA)溶解于40 mL 去離子水中，加熱充分溶解后，記為“B 液”;最后將A 液與B 液緩慢混合搖勻后得到CAS 檢測(cè)溶液。

1.4 鐵載體活性檢測(cè)

菌株YIM PH30002 產(chǎn)鐵載體固體平板檢測(cè)參照文獻(xiàn)［6，7］，采用雙層瓊脂法，上層為培養(yǎng)基(分別為PDA、改良馬丁、察氏3 種)，下層為添加有4 %的CAS 溶液的水瓊脂，用直徑為5 mm 的打孔器從YIM PH30002 菌株平板內(nèi)移取菌塊接入雙層平板中央，接種后放置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察菌落周圍特征暈圈顏色變化。菌株YIM PH30002 在以上3 種液體培養(yǎng)基的發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物鐵載體活性成分檢測(cè)參照文獻(xiàn)［8］，將粗提物用甲醇溶解，粗提物的濃度檢測(cè)范圍設(shè)置為10～1000 μg/mL，按等體積比與CAS 溶液加入96 孔板內(nèi)，反應(yīng)總體系80 μL，以溴化十六烷基三甲銨(CTAB)作為陽(yáng)性對(duì)照，甲醇作為陰性對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)，并同時(shí)觀察特征顏色變化，將能引起CAS 檢測(cè)液出現(xiàn)特征顏色變化時(shí)的粗提物濃度記為最小檢測(cè)濃度(Minimum test concentration，MTC)值。單體化合物鐵載體活性的MTC 值測(cè)定同粗提物的檢測(cè)方法與步驟一致。

1.5 發(fā)酵與提取分離

將菌株接種斜面活化培養(yǎng)5 d，接種于500 mL錐形瓶中(含有150 mL PDB 培養(yǎng)基)置搖床上130 rpm，28 ℃培養(yǎng)3 d;將種子培養(yǎng)液按8%～10%(v/v)接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基(PDB)中，置搖床上130 rpm，28 ℃培養(yǎng)10 d，共發(fā)酵50 L。發(fā)酵后用紗布過濾分離發(fā)酵液與菌絲體。用等體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液三次，合并提取液，并真空濃縮蒸干，菌絲體使用過量丙酮浸泡并超聲破壁15 min，用等體積的乙酸乙酯萃取丙酮提取物三次并濃縮蒸干。兩部分萃取物經(jīng)TLC 和HPLC 檢測(cè)分析后合并得到總浸膏43.6 g。粗提物用等體積比的石油醚相與甲醇/水相(9∶1，v/v)溶解分離萃取3 次，甲醇/水相經(jīng)真空濃縮蒸干后，經(jīng)正向硅膠色譜，以氯仿/甲醇(1∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1，v/v)梯度洗脫得到六個(gè)組分(Fr.1～6)。其中組分Fr.1 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜以甲醇洗脫，得到四個(gè)組分(Fr.1.1～1.4)，其中Fr.1.2 進(jìn)一步經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜以甲醇洗脫得到化合物2，konginginin B(20.1 mg)，F(xiàn)r.1.2 剩余組分經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚/丙酮(10∶1-5∶1)梯度洗脫得到化合物1，konginginin A(18.1 mg)，F(xiàn)r.1.1 組分經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜以甲醇洗脫后經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚/丙酮(10∶1～1∶1)梯度洗脫得到化合物5，konginginin M(14.3 mg)。組分Fr.2 經(jīng)MCI 柱色譜以甲醇/水(10%～100%)梯度洗脫得到三個(gè)組分Fr.2.1～Fr.2.3，其中組分Fr.2.1 經(jīng)半制備HPLC 以甲醇/水(10%～100%)作為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為3.0 mL/min，分別得到化合物3，konginginin D(7.5 mg)和4，konginginin F(8.6 mg)。

1.6 抑菌活性分析

單體化合物抗菌活性分析參照文獻(xiàn)［9］，采用微量稀釋法于96 孔板分析單體化合物的最小抑菌濃度(MIC)值?；衔镆远谆鶃嗧?DMSO)溶解，采用二倍連續(xù)稀釋法將化合物檢測(cè)濃度范圍設(shè)置為1～256 μg/mL，DMSO 在每個(gè)孔中的終濃度小于5%;以鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumanii)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為病原指示細(xì)菌，用LB 培養(yǎng)基將細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)18 h 后使菌落數(shù)為1×105units/mL;以尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum)、人參鏈格孢(Alternaria panax)、腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)為病原指示真菌，用PDB 培養(yǎng)基將真菌在28 ℃培養(yǎng)24 h 后使菌落數(shù)為1×103units/mL;卡那霉素與制霉菌素分別作為抗細(xì)菌與真菌的陽(yáng)性對(duì)照，DMSO 作為陰性對(duì)照;每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)，最后將接有細(xì)菌的板放置37 ℃培養(yǎng)24 h，接有真菌的96 孔板置28 ℃培養(yǎng)36 h 后，置顯微鏡下觀察記錄，最終將觀察到孔中無菌體生長(zhǎng)時(shí)所在化合物濃度定為該化合物的最小抑制濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 鐵載體活性

采用由真菌常用的培養(yǎng)基與通用CAS 檢測(cè)平板構(gòu)成的雙層平板，擬康氏木霉菌YIM PH30002 能在上層的3 種不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，且在下層的CAS 檢測(cè)平板上能夠形成典型的鐵載體螯合暈圈。從表1 結(jié)果可看出菌株YIM PH30002 在上層為PDA 培養(yǎng)基時(shí)所產(chǎn)生的鐵載體特征暈圈大于在察氏與改良馬丁培養(yǎng)基所形成的暈圈，且菌株在察氏培養(yǎng)基中產(chǎn)鐵載體能力相對(duì)最弱;對(duì)菌株YIM PH30002 產(chǎn)鐵載體形成的特征型螯合暈圈進(jìn)行半定量分析，結(jié)果見表1，由于菌株在PDA 培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度最快，相應(yīng)的鐵載體螯合暈圈較大，因此，在鐵載體螯合暈圈與菌落的直徑比值上最大，由此可知，菌株YIM PH30002 在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)鐵載體能力最強(qiáng)。菌株YIM PH30002 在3 種不同培養(yǎng)基液體發(fā)酵的萃取粗提物鐵載體檢測(cè)分析結(jié)果見表2，由于CTAB 是最常用的金屬離子螯合劑，所以將其作為陽(yáng)性對(duì)照，CTAB 引起CAS 檢測(cè)液出現(xiàn)特征顏色變化的 MTC 值為10 μg/mL;菌株 YIM PH30002 在察氏與改良馬丁培養(yǎng)基發(fā)酵液中萃取的粗提物引起CAS 檢測(cè)液出現(xiàn)特征顏色變化的MTC值分別為150 μg/mL 和100 μg/mL，而PDB 培養(yǎng)基發(fā)酵液萃取粗提物的MTC 值為50 μg/mL，與平板法檢測(cè)結(jié)果一致，因此MTC 值可以作為微生物產(chǎn)鐵載體能力的定量分析?；衔?～5 對(duì)鐵離子螯合活性的MTC 值分析結(jié)果見表2，結(jié)果表明，化合物5在濃度即使大于1000 μg/mL 時(shí)也未能引起CAS 檢測(cè)液出現(xiàn)特征顏色變化，即無鐵載體活性，化合物2的鐵載體活性相對(duì)化合物1、3 和4 較強(qiáng)，其MTC 值為300 μg/mL。

表1 YIM PH30002 在3 種培養(yǎng)基產(chǎn)鐵載體比較Table 1 Comparison of siderophores produced by strain YIM PH30002 in three medium

表2 YIM PH30002 不同發(fā)酵液的粗提物與化合物1～5 的鐵載體活性Table 2 The siderophores activities of the crude extracts and compounds 1-5

圖1 化合物1～5 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-5

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物(1)Koninginin A，無色油狀，C16H28O4;HR-ESI-MS m/z:307.1913［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.32(1H，s，H-9)，4.03(1H，m，H-10)，3.89(1H，dd，J=11.2，2.4Hz，H-1)，3.62(1H，m，H-4)，2.25(1H，m，H-8a)，1.58(1H，m，H-8b)，1.97(1H，m，H-3a)，1.82(1H，m，H-3b)，1.88(1H，m，H-2a)，1.52(1H，m，H-2b)，1.72(1H，m，H-7a)，1.61(1H，m，H-7b)，1.60(1H，m，H-6)，1.57(2H，m，H-11)，1.30(2H，m，H-14)，1.28(2H，m，H-13)，1.28(2H，m，H-15)，1.27(2H，m，H-12)，0.88(3H，t，J=6.0Hz，H-16);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:109.2(C-5)，79.4(C-10)，79.1(C-9)，72.7(C-4)，69.9(C-1)，41.4(C-6)，35.2(C-11)，31.7(C-14)，30.8(C-2)，29.1(C-13)，27.3(C-8)，25.6(C-3)，25.2(C-12)，22.5(C-15)，20.6(C-7)，14.0(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道一致。確定該化合物為koninginin A。

化合物(2)Koninginin B，無色油狀，C16H26O4;HR-ESI-MS m/z:305.1773［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.04(1H，dd，J=13.2，5.2 Hz，H-2)，3.87(1H，s，2-OH)，3.78(1H，m，H-9)，3.64(1H，br s，10-OH)，3.77(1H，m，H-10)，2.56(1H，m，H-4a)，2.08(1H，m，H-4b)，2.35(1H，m，H-3a)，1.80(1H，m，H-3b)，1.95(1H，m，H-7a)，1.66(1H，m，H-7b)，1.65(1H，m，H-8a)，1.55(1H，m，H-8b)，1.35(2H，m，H-12)，1.33(2H，m，H-11)，1.30(1H，m，H-13)，1.31(2H，m，H-14)，1.29(2H，m，H-15)，0.87(3H，t，J=7.2Hz，H-16);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:198.5(C-1)，171.8(C-5)，109.5(C-6)，81.2(C-9)，73.5(C-10)，71.4(C-2)，33.2(C-4)，32.2(C-11)，29.7(C-14)，29.4(C-13)，27.6(C-3)，25.8(C-8)，23.1(C-12)，23.0(C-15)，18.1(C-7)，14.5(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道一致。確定該化合物為koninginin B。

化合物(3)Koninginin D，無色油狀，C16H26O5;HR-ESI-MS m/z:321.1792［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.66(1H，br s，H-7)，4.45(1H，m，H-4)，4.10(1H，m，H-9)，3.72(1H，m，H-10)，2.64(1H，m，H-2a)，2.37(1H，m，H-2b)，2.23(1H，m，H-3a)，2.01(1H，m，H-3b)，1.97(1H，m，H-8a)，1.77(1H，m，H-8b)，1.60(2H，m，H-12)，1.58(1H，m，H-11a)，1.48(1H，m，H-11b)，1.31(2H，m，H-13)，1.30(2H，m，H-14)，1.30(2H，m，H-15)，0.89(3H，t，J=7.2Hz，H-16);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:198.5(C-1)，171.1(C-5)，114.2(C-6)，77.4(C-9)，73.1(C-10)，65.7(C-4)，57.3(C-7)，33.1(C-2)，32.8(C-11)，31.7(C-14)，30.9(C-13)，29.2(C-8)，28.8(C-3)，25.2(C-12)，22.6(C-15)，14.0(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道一致。確定該化合物為koninginin D。

化合物(4)Koninginin F，無色油狀，C16H26O5;HR-ESI-MS m/z:321.1797［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.80(1H，br s，H-7)，4.08(1H，m，H-9)，4.06(1H，m，H-2)，3.69(1H，s，H-10)，2.62(1H，m，H-4a)，2.37(1H，m，H-4b)，2.35(1H，m，H-3a)，1.98(1H，m，H-3b)，1.97(1H，m，H-8a)，1.80(1H，m，H-8b)，1.62(2H，m，H-11)，1.51(2H，m，H-12)，1.31(2H，m，H-13)，1.30(2H，m，H-14)，1.29(2H，m，H-15)，0.88(3H，t，J=7.0Hz，H-16);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:198.3(C-1)，173.5(C-5)，112.6(C-6)，77.3(C-9)，72.8(C-10)，71.0(C-2)，57.2(C-7)，33.1(C-4)，31.7(C-11)，31.4(C-14)，29.2(C-13)，28.6(C-8)，27.1(C-3)，25.4(C-12)，22.6(C-15)，14.0(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道一致。確定該化合物為koninginin F。

化合物(5)Koninginin M，無色油狀，C16H24O4;HR-ESI-MS m/z:303.1620［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.99(1H，d，J=5.6 Hz，H-7)，4.83(1H，br s，H-9)，4.05(1H，m，H-10)，3.94(1H，dd，J=7.9，5.2 Hz，H-2)，3.81(1H，br s，2-OH)，2.53(2H，m，H-4)，2.35(1H，m，H-3a)，1.83(1H，m，H-3b)，1.64(1H，m，H-11a)，1.48(1H，m，H-11b)，1.30(2H，m，H-12)，1.30(2H，m，H-13)，1.28(2H，m，H-14)，1.28(2H，m，H-15)，0.88(3H，t，J=7.2Hz H-16);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:194.8(C-1)，173.8(C-5)，116.1(C-6)，85.9(C-10)，79.5(C-9)，70.9(C-2)，66.2(C-7)，32.5(C-8)，31.7(C-11)，31.6(C-14)，29.2(C-13)，29.0(C-3)，26.4(C-4)，26.3(C-12)，22.5(C-15)，14.1(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道一致，確定該化合物為koninginin M。

2.3 抑菌活性

抑菌活性分析結(jié)果(表3)表明，化合物1～5 對(duì)檢測(cè)的病原指示真菌無顯著的抑菌活性，MIC 值范圍為128～256 μg/mL，而對(duì)病原指示細(xì)菌無抑菌活性，其MIC 值均大于256 μg/mL。

表3 化合物(1～5)對(duì)微生物的最小抑制濃度(MICs)Table 3 Minimal inhibitory concentration of compounds(1-5)against tested microorganisms

2.4 討論

鐵元素是大部分微生物生長(zhǎng)的必須元素，真菌、細(xì)菌能通過自身代謝產(chǎn)生對(duì)環(huán)境中鐵離子具有螯合活性的化合物［5］，CAS 平板法已被廣泛用于微生物產(chǎn)鐵載體潛能檢測(cè)［14］。鐵離子、CAS 和HTDMA 會(huì)絡(luò)合形成藍(lán)色復(fù)合物(FeDye3-x)其具體顯色原理可用化學(xué)式:FeDye3-x+Ly-→FeL3-y+Dyex-表示，當(dāng)對(duì)Fe3+具有更高親和力的配體(L)出現(xiàn)，如將鐵載體加入FeDye3-x 藍(lán)色復(fù)合物中，復(fù)合物中的鐵離子便會(huì)轉(zhuǎn)移到配體上，而釋放出染料，此時(shí)溶液的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色、紫色或橙色。因此用雙層瓊脂平板法可在平板上觀察到典型鐵載體顏色暈圈，微生物代謝提取物與CAS 溶液的理化反應(yīng)同樣可通過特征顏色變化來判斷化合物鐵離子螯合強(qiáng)度。本文研究發(fā)現(xiàn)菌株YIM PH30002 在三種不同培養(yǎng)基中產(chǎn)鐵載體能力存在差異，其在PDA 培養(yǎng)基上特征顏色暈圈最大。鐵載體特征螯合暈圈與菌落直徑比值作為產(chǎn)鐵載體能力的一種半定量分析方法［15］，與菌株YIM PH30002 在三種不同液體培養(yǎng)基發(fā)酵液的提取物與CAS 檢測(cè)液的理化反應(yīng)的定量分析方法結(jié)果一致。微生物所產(chǎn)鐵載體是一類較特殊的天然產(chǎn)物，近年來圍繞微生物所產(chǎn)鐵載體的功能與機(jī)制等方面引發(fā)了廣泛討論:研究發(fā)現(xiàn)阻斷結(jié)核桿菌鐵載體循環(huán)通路可誘發(fā)自毒效應(yīng)，即內(nèi)源鐵載體物質(zhì)積累導(dǎo)致結(jié)合桿菌死亡，這為結(jié)核病藥物的研發(fā)提供了新的靶標(biāo)［16］;研究還表明微生物產(chǎn)生鐵載體可促進(jìn)植物生長(zhǎng)［17］，抑制病原菌等作用［18］。本文首次報(bào)道三七內(nèi)生真菌擬康氏木霉菌YIM PH30002具有產(chǎn)鐵載體的能力，并發(fā)現(xiàn)了部分化合物具有一定的鐵載體活性，但未能發(fā)現(xiàn)具有極強(qiáng)鐵離子螯合活性的單體，這與粗提物顯示的螯合活性存在差異，可能與化合物間的協(xié)同作用有一定關(guān)聯(lián)，有關(guān)菌株YIM PH30002 分泌的鐵載體代謝產(chǎn)物對(duì)鐵離子的協(xié)同螯合作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

1 Samuels GJ.Trichoderma:a review of biology and systematics of the genus.Mycol Res，1996，8:923-935.

2 Keswani C，Mishra S，Sarma BK，et al.Unraveling the efficient applications of secondary metabolites of various Trichoderma spp.Appl Microbiol Biot，2014，98:533-544.

3 Haas H.Molecular genetics of fungal siderophore biosynthesis and uptake:the role of siderophores in iron uptake and storage.Appl Microbiol Biot，2003，62:316-330.

4 Vinale F，Nigro M，Sivasithamparam K，et al.Harzianic acid:a novel siderophore from Trichoderma harzianum.FEMS Microbiol Lett，2013，347:123-129.

5 Hider RC，Kong XL.Chemistry and biology of siderophores.Nat Prod Rep，2010，27:637-657.

6 Miranda SP，Cabirol N，Téllez RG，et al.O-CAS，a fast and universal method for siderophore detection.J Microbiol Meth，2007，70:127-131.

7 Milagres AM，Machuca A，Napoleao D.Detection of siderophores production from several fungi and bacteria by a modification of chromeazurol S(CAS)agar plate assay.J Microbiol Meth，1999，37:1-6.

8 Schwyn B，Neilands JB.Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.Anal Biochem，1987，160:46-56.

9 Tian SZ，Pu X，Luo GY，et al.Isolation and characterization of new p-terphenyls with antifungal，antibacterial，and antioxidant activities from halophilic antinomycete Nocardiopsis gilva YIM 90087.J Agric Food Chem，2013，61:3006-3012.

10 Xu XX，Zhu YH.Total synthesis of koninginin A and its diastereoisomer.Tetrahedron Lett，1995，36:9173-9176.

11 Liu G，Wang Z.Total synthesis of koninginin D，B and E.Synthesis，2001，1:119-127.

12 Ghisalberti EL，Rowland CY.Antifungal metabolites from Trichoderma harzianum.J Nat Prod，1993，56:1799-1804.

13 Lang BY，Li J，Zhou XX，et al.Koninginins L and M，two polyketides from Trichoderma koningii 8662.Phytochem Lett，2015，11:1-4.

14 Shin SH，Lim Y，Lee SE，et al.CAS agar diffusion assay for the measurement of siderophores in biological fluids.J Microbiol Meth，2001，44:89-95.

15 Chen SX(陳紹興)，Zhao X(趙翔)，Xie ZX(謝志雄).Detection of siderophore from Halophilic archaea with two-layer plate.Microbiol China(微生物學(xué)通報(bào))，2008，35:142-144.

16 Jones CM，Wells RM，Madduri AVR，et al.Self-poisoning of Mycobacterium tuberculosis by interrupting siderophore recycling.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111:1945-1950.

17 Sadeghi A，Karimi E，Dahaji PA，et al.Plant growth promoting activity of an auxin and siderophore producing isolate of Streptomyces under saline soil conditions.World J Microb Biot，2012，28:1503-1509.

18 Miethka M，Marahiel MA.Siderophore-based iron acquisitionand pathogen control.Microbiol Mol Biol Res，2007，71:413-451.