大馬哈魚鼻軟骨中硫酸軟骨素提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

趙 丹，曹 榮，高紅巖，劉 淇

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連116000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071）

大馬哈魚鼻軟骨中硫酸軟骨素提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

趙 丹1,2，曹 榮2，高紅巖1，劉 淇2

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連116000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071）

為有效提高大馬哈魚的綜合利用程度，以硫酸軟骨素（CS）得率為指標，考察了p H值、溫度、時間、料液比等因素對大馬哈魚鼻軟骨中CS提取效果的影響，并在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對提取工藝進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，溫度、時間、料液比是影響大馬哈魚鼻軟骨中CS得率的主要因素；最佳提取工藝條件為溫度53.1℃、時間3.6 h、料液比1∶43.4，在此條件下CS得率理論值可達21.40%。3次驗證試驗CS的平均得率為21.28%，與模型預(yù)測值的相對誤差僅為0.56%，表明建立的回歸模型與實際情況擬合良好。

大馬哈魚鼻軟骨；硫酸軟骨素（CS）；提取工藝；響應(yīng)面分析

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，CS）是存在于動物組織器官中的一種酸性粘多糖，以蛋白聚糖的形式存在于軟骨、腱、韌帶和主動脈等組織中[1-3]。其中軟骨是獲取CS的最佳來源[4]。國內(nèi)多以豬、牛、雞的軟骨作為提取原料，已有研究表明陸生動物CS在結(jié)構(gòu)上以A型為主，而水生動物CS以C型居多[5]，其二糖單元上硫酸基團的取代位置發(fā)生變化，形成多種同分異構(gòu)體[6]。

目前，已知可從鯊魚、鰩、鱘魚、魷魚等魚類的軟骨組織中獲取CS，而從大馬哈魚鼻軟骨中提取CS的研究報道相對較少。國外研究表明大馬哈魚鼻軟骨中的蛋白聚糖結(jié)構(gòu)較為獨特且具有良好功能[7-8]。因此，大馬哈魚鼻軟骨中CS提取工藝的研究具有重要的現(xiàn)實意義。

CS常見的提取方法有堿法[9]、酶法[10-11]和超聲輔助法[12-13]等。不同的原料，其適用的提取方法有很大差異。本研究以大馬哈魚鼻軟骨為原料，采用堿性水溶液浸提硫酸軟骨素。先通過單因素試驗考察相關(guān)因素對CS得率的影響，然后采用響應(yīng)面法對浸提工藝進行優(yōu)化，以獲取最佳的工藝參數(shù)，以期為大馬哈魚鼻軟骨這種加工下腳料的高值化綜合利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

大馬哈魚魚頭骨混合物由山東煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司提供，從大馬哈魚魚頭骨混合物中挑揀出鼻軟骨，用清水沖洗干凈后瀝干，再凍干粉碎，儲存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑有D-葡萄糖醛酸內(nèi)酯、咔唑（北京索萊寶科技有限公司），硼砂、無水乙醇、濃硫酸（國產(chǎn)分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 CS的提取與測定 （1）提取。取一定量的軟骨粉加水浸提，然后離心取上清液，再通過0.45m的濾膜進一步除去殘留的雜質(zhì)，得到提取液，測定CS的含量。（2）測定。采用Muir等提出的硫酸-咔唑法[14]，通過測定硫酸軟骨素中的糖醛酸組分（N-乙酰半乳糖胺），間接衡量CS的含量[15-16]。

CS含量=C×V×n×10-6÷45.12%

CS得率（%）=CS含量÷M×100

式中，C為糖醛酸的質(zhì)量濃度（μg/m L），V為提取液體積（m L），n為稀釋倍數(shù)；M為軟骨質(zhì)量（干重，g）。以D-葡萄糖醛酸內(nèi)酯的質(zhì)量濃度為橫坐標，以530 nm下的吸光度為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 D-葡萄糖醛酸內(nèi)酯標準曲線

1.2.2 單因素試驗 （1）pH值：固定料液比為1︰60、溫度為50℃、時間為4 h，調(diào)整pH值分別為2、4、6、8、10、12，考察浸提液pH值對CS得率的影響。（2）溫度：固定pH值為10、料液比為1︰60、時間為4 h，分別在30、40、50、60、70℃下進行提取，考察溫度對CS得率的影響。（3）料液比：固定pH值為10、時間為4 h、溫度為50℃，分別設(shè)置1︰30、1︰40、1︰50、1︰60、1︰70的料液比進行提取，考察料液比對CS得率的影響。（4）時間：固定pH值為10、溫度為50℃、料液比為1︰50，分別提取0.5、1、2、3、4、8、12 h，考察時間對CS得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定溫度、時間、料液比為影響得率的主要因素。利用Design-expert 7.1.6軟件進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，并對所得數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

由圖2A可知，在酸性條件下，CS得率較低，而在堿性條件下，CS得率明顯提高；當(dāng)pH值為10時，CS得率最高；當(dāng)pH值為12時，CS得率下降，這可能與強堿條件下CS發(fā)生降解有關(guān)。

從圖2B中可以看出，溫度過低或過高都不利于CS的提取，當(dāng)溫度為50℃左右時，CS得率最高。

在實際生產(chǎn)過程中，料液比對成本有較大影響，在不顯著影響CS得率的前提下，應(yīng)盡可能減少提取過程中水溶液的用量。由圖2C可知，料液比為1︰30時，CS得率較低，當(dāng)料液比為1︰40時，CS得率顯著增加，之后隨著溶液比例增大，CS得率增加的趨勢變緩，料液比為1︰50時基本達到最大。

從圖2D中可以看出，在提取的前3 h內(nèi)，CS得率顯著增加，3 h后增速趨緩。

圖2 各因素對CS得率的影響（A：p H值；B：溫度；C：料液比；D：時間）

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化CS提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 由表1可知，以處理4，即溫度為45℃，時間3 h，料液比為1︰45的條件下，CS得率最高，為20.83%；以處理9，即溫度為30℃，時間1 h，料液比為 1︰45的條件下，CS得率最低，僅14.15%。此外，處理1～5和處理13的CS得率在20%以上，其他處理的CS得率均低于20%。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析 由表2可知，回歸模型的P值＜0.000 1，表明模型極其顯著，而失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型選擇合適，與實際情況擬合良好，且，各因素之間的交互作用顯著。各因素對CS得率的影響依次為：溫度（A）＞時間（B）＞料液比（C）。模型的擬合方程為：Y=20.73+1.92A+1.07B+ 0.17C-1.00AB-0.80AC-0.34BC-1.60A2-0.96B2-1.15C2。

2.2.3 因素交互作用分析 （1）溫度與時間。由圖3可知，溫度較低時，延長時間有利于CS的溶出；溫度較高時，短時間浸提就可獲得較高的CS得率。從等高線圖可以看出，溫度為52.5～54℃，時間在3～3.5 h的范圍內(nèi)，CS得率可達到曲面的最大值。（2）溫度與料液比。由圖4可知，當(dāng)料液比在1︰55～1︰30范圍內(nèi)，溫度小于45～52.5℃時，CS得率隨溫度的增加而提高；溫度較低時CS得率偏低，而溫度較高時有利于CS的提取。從等高線圖可以看出，當(dāng)溫度為51～54℃，料液比為1︰45～1︰43時，CS得率可達到曲面的最大值。（3）時間與料液比。由圖5可知，當(dāng)時間固定在2.5～5 h范圍時，料液比適中時有利于CS的提取，過高或過低的料液比CS得率均下降。而當(dāng)料液比一定時，時間小于2.75～3.5 h時，CS得率隨時間的增加而提高，但低于曲面的最高點。從等高線圖可以看出，當(dāng)時間為2.75～5 h，料液比為1︰52.5～1︰37.5時，CS得率可達到曲面的最大值。

表2 響應(yīng)面回歸模型方差分析

圖3 Y=f（溫度A，時間B）響應(yīng)曲面與等高線圖（料液比1︰45）

圖4 Y=f（溫度A，料液比C）響應(yīng)曲面與等高線圖（時間3h）

圖5 Y=f（時間B，料液比C）響應(yīng)曲面與等高線圖（溫度45℃）

2.2.4 試驗驗證 利用Design-Expert軟件對回歸方程求解，得到CS提取的最佳工藝為：溫度53.1℃，時間3.6 h，料液比1︰43.4，預(yù)測的理論值為21.40%。在此條件下進行驗證試驗，3次試驗的CS平均得率為21.28%，與預(yù)測值的相對誤差僅為0.56%，證明該模型適宜對CS提取效果進行預(yù)測和分析。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，溫度、時間和料液比是影響大馬哈魚鼻軟骨中CS提取效率的主要因素，通過響應(yīng)面設(shè)計和分析，建立了CS提取的二次回歸模型，確立的最佳工藝參數(shù)為溫度53.1℃，時間3.6 h，料液比1︰43.4，此條件下CS得率可達21%以上。該工藝操作簡便、成本低廉，為大馬哈魚鼻軟骨這種加工下腳料的高值化綜合利用提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Optim ization of Chondroitin Sulfate Extraction from Salmon Nasal Cartilage by Response Surface M ethod

ZHAODan1,2，CAORong2，GAOHong-yan1，LIUQi2
（1.Departmentof Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116000,PRC;2.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,PRC）

Salmon nasal cartilage is rich in chondroitin sulfate.In order to effectively increase the degree of comprehensive utilization of salmon,single factor experimentsw ere carried out to study the effectsof pH,tem perature,time and ratio ofmaterial to solventon CS yield. Based on this,response surfacemethod was used to optim ize the process parameters to seek an optimal solution.The results show ed that the temperature,time and ratio ofmaterial to solventweremajor influence factors,in the optimal condition of 53.1℃,3.6h time and 1︰43.4 ratio ofmaterial to solvent,the CS yield was 21.28%.The relative errorwas 0.56%w ith respect to the predicted maximum 21.40%, indicating that theestablished regressionmodel fittedwellw ith theactualsituation.

salmon nasal cartilage(CS);chondroitin sulfate;extraction process;response surfaceanalysis

TS254.9

A

1006-060X（2015）01-0095-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.01.031

2014-11-24

2013～2015年工信部高技術(shù)船舶科研計劃項目

趙 丹（1989-），女，內(nèi)蒙古巴彥淖爾市人，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品加工。

劉 淇