骨髓單個核細(xì)胞熱休克蛋白27表達在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床價值*

王 清,張梅芳,郭曉麗,王良宏,宋 軍,袁 斌,陳 馳,郭鵬翔，朱紅倩

(1.貴州省人民醫(yī)院血液科，貴陽550001；2.河北省新樂市人民醫(yī)院內(nèi)科 050700；3.貴陽醫(yī)學(xué)院臨床免疫教研室，貴陽 550004；4.貴州省腫瘤醫(yī)院血液科，貴陽550000；5.貴陽中醫(yī)學(xué)院免疫教研室，貴陽550001)

論著·臨床研究

骨髓單個核細(xì)胞熱休克蛋白27表達在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床價值*

王 清1,張梅芳2,郭曉麗1,王良宏3,宋 軍1,袁 斌4,陳 馳5,郭鵬翔1，朱紅倩1

(1.貴州省人民醫(yī)院血液科，貴陽550001；2.河北省新樂市人民醫(yī)院內(nèi)科 050700；3.貴陽醫(yī)學(xué)院臨床免疫教研室，貴陽 550004；4.貴州省腫瘤醫(yī)院血液科，貴陽550000；5.貴陽中醫(yī)學(xué)院免疫教研室，貴陽550001)

目的 探討骨髓單個核細(xì)胞熱休克蛋白27(HSP27)表達與多發(fā)性骨髓瘤(MM)臨床特征的關(guān)系。方法收集初治多發(fā)性骨髓瘤患者86例，復(fù)發(fā)難治患者27例，對照組為非血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者,根據(jù)治療方案的不同，MM患者分為初治組、復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組及含硼替佐米化療組。分別于化療前、化療后1、2、3療程檢測骨髓單個核細(xì)胞HSP27的表達率及蛋白水平。結(jié)果化療前各組HSP27表達量及蛋白水平趨勢為：復(fù)發(fā)難治組大于初治組大于對照組。初治組中Ⅲ期患者的HSP27明顯高于Ⅱ期患者。含硼替佐米化療方案可明顯降低HSP27的表達及蛋白水平，含硼替佐米化療方案抑制HSP27的表達力度明顯優(yōu)于常規(guī)化療組?；熀?個療程HSP27的表達量小于1的患者，其死亡率、復(fù)發(fā)率明顯低于HSP27表達量大于1的患者，且復(fù)發(fā)時間明顯延后。結(jié)論骨髓單個核細(xì)胞HSP27的表達及蛋白水平與多發(fā)性骨髓瘤的分期、治療應(yīng)答、預(yù)后相關(guān)。

多發(fā)性骨髓瘤；熱休克蛋白質(zhì)類；預(yù)后；治療應(yīng)答

熱休克蛋白(HSP)的作用主要體現(xiàn)為應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞保護作用(抗凋亡)[1]。然而，HSP的這種細(xì)胞保護機制亦可促進腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥抵抗的發(fā)生[2]。既往研究證實在卵巢、胸部、腸道、肝、前列腺腫瘤中，HSP家族的一員——HSP27的表達與預(yù)后較差相關(guān)[3]。而在頭、頸腫瘤中，HSP27的表達卻與預(yù)后無相關(guān)性[4]。上述研究表明盡管HSP27與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)特性、轉(zhuǎn)歸相關(guān)，但其在不同的腫瘤中的臨床意義亦有不同。近年來，國外學(xué)者通過體外、動物模型實驗證實HSP27與多發(fā)性骨髓瘤(MM)的耐藥相關(guān)，并肯定了HSP27在MM中的過度表達[5-8]。然而，尚無大宗針對HSP27的表達與MM關(guān)系的臨床研究。本研究通過對MM骨髓單個核細(xì)胞(BMMNC)-HSP27基因及蛋白表達水平的檢測，初步探討HSP27表達與MM治療、緩解率、預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2010年8月至2013年12月初治MM患者86例，復(fù)發(fā)難治MM患者27例，對照組為非血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者(缺鐵性貧血42例，巨幼紅細(xì)胞性貧血25例)。MM的診斷、治療、療效評判標(biāo)準(zhǔn)參照2008～2011修訂版《中國多發(fā)性骨髓瘤治療指南》(2012年搜集病例均采用2011修訂版)。3組患者在年齡構(gòu)成、性別、分類、分期等方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其中，MM初治及復(fù)發(fā)難治組均以IgG型為主(45.35%，44.44%)，分期以Ⅲ期為主(69.53%，100%)。初治組與復(fù)發(fā)難治組的骨髓漿細(xì)胞比例分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。初治組86例患者中，46.51%的患者選擇常規(guī)化療方案，僅9.31%的患者選擇含硼替佐米化療方案。復(fù)發(fā)難治組中，48.42%的患者選擇常規(guī)化療方案，51.58%的患者選擇含硼替佐米化療方案。復(fù)發(fā)難治組選擇硼替佐米者明顯高于初治組。MM患者均行多部位穿刺(≥3)及骨髓活檢，每例標(biāo)本由3名形態(tài)室人員閱片，計數(shù)細(xì)胞大于或等于500個。

表1 各組BMMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平

1.2 方法

1.2.1 骨髓單個核細(xì)胞HSP27的相對表達率測定 化療前采集患者骨髓標(biāo)本5 mL，采用密度梯度離心法獲取BMMNC，采用QRT-PCR對BMMNC-HSP27的mRNA表達水平進行檢測。BMMNC的HSP27引物合成、相對表達率測定參照既往文獻進行[9]。應(yīng)用7500 Sequence Detection Software分析(Applied Biosystems，Carlsbad,California,USA)。用2-△△CT法做相對定量(每樣本重復(fù)3次)。

1.2.2 BMMNC HSP27水平的ELISA測定 將上述步驟獲取的BMMNC標(biāo)本，使用上海西塘生物科技有限公司提供的人HSP27 ELISA試劑盒，按試劑說明書進行操作，對BMMNC的HSP27水平進行測定。

1.2.3 分組 鑒于本研究為回顧性分析，因此，分組比較包括：(1)初治、復(fù)發(fā)難治、對照組不同骨髓漿細(xì)胞亞組間的BMMNC-HSP27的mRNA及蛋白表達水平；(2)初治、復(fù)發(fā)難治組間不同免疫分型亞組的BMMNC-HSP27的mRNA及蛋白表達水平；(3)初治、復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療、含硼替佐米化療組的BMMNC-HSP27在不同時間點的蛋白及mRNA表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓瘤患者與對照組BMMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平 初治、復(fù)發(fā)難治組不同骨髓漿細(xì)胞比例亞組間的HSP27 mRNA表達及蛋白水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示骨髓漿細(xì)胞比例的不同對BMMNC-HSP27的mRNA及蛋白水平表達無影響。此外，在不同的骨髓漿細(xì)胞比例分組中均可觀察到：初治組、復(fù)發(fā)難治組的BMMNC-HSP27 mRNA表達水平均明顯高于對照組，組內(nèi)多重比較表明復(fù)發(fā)難治組的BMMNC-HSP27相對表達率明顯高于初治組。相同的趨勢亦見于BMMNC-HSP27蛋白水平。ELISA檢驗結(jié)果表明：BNNMC-HSP27的蛋白水平，初治組明顯高于對照組，而復(fù)發(fā)難治組則高于初治組，見表1。

2.2 MM患者BMMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平在MM不同分型中的變化 初治、復(fù)發(fā)難治組的BMMNC-HSP27的mRNA表達在不同的分型中比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。初治、復(fù)發(fā)難治組的BNNMC-HSP27的蛋白水平在不同的骨髓瘤分型中比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.609)。見表2。

表2 MM患者MMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平在MM不同分型中的變化

2.3 初治組患者BMMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平在MM不同分期中的變化 Ⅲ期MM患者BMMNC-HSP27的mRNA表達明顯高于Ⅱ期患者，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。Ⅲ期患者BNNMC-HSP27的蛋白水平明顯高于Ⅱ期患者，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)。見表3。

表3 初治組患者MMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平在MM不同分期中的變化

2.4 MMNC-HSP27的mRNA表達、蛋白水平與治療應(yīng)答的相關(guān)性 由圖1可知：分組、時間因素對BMMNC-HSP27相對表達率的影響具有顯著性(交互效應(yīng)、分組、時間主效應(yīng)P<0.05)。固定時間因素可知：治療前、治療后1個療程HSP27的相對表達量從高到低均為復(fù)發(fā)難治硼替佐米化療組、復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組、初治硼替佐米化療組及初治常規(guī)化療組；治療后2療程，復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組的BNNMC-HSP27表達最高(1.70±0.49)，其余3組雖低于復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1.02±0.48,0.86±0.48,0.54±0.58)。相同的趨勢亦可于治療后3個療程觀察到。固定分組因素：初治常規(guī)化療組的BMMNC-HSP27相對表達率在1～2個化療周期內(nèi)呈進行性降低，但化療后2～3個療程間相比HSP27的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組治療后1個療程BMMNC-HSP27的表達無明顯變化，于治療后2～3個療程雖稍降低，但降低幅度明顯低于其余3組。初治硼替佐米化療組中，治療后1個療程，HSP27的表達明顯降低，其后，隨療程推移而保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)；復(fù)發(fā)難治硼替佐米化療組中，HSP27與化療后1～2個療程出現(xiàn)進行性降低，但于化療后2～3個療程保持相對穩(wěn)定狀態(tài)。BNNMC-HSP27的蛋白水平的變化趨勢與mRNA變化大致相同。

*：P<0.05，**：P<0.01，與初治常規(guī)化療組(治療前)比較；#：P<0.05，##：P<0.01，組內(nèi)兩兩比較。不同的條圖模型代表不同的治療狀態(tài)(時間點)。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。

圖1 BMMNC-HSP27 mRNA表達及蛋白水平在不同分組、不同時間點的變化趨勢

2.5 MMNC-HSP27的mRNA表達、蛋白水平與預(yù)后的相關(guān)性 113例患者中，17例失隨訪，隨訪率為84.96%。隨訪病例中，放棄治療11例，轉(zhuǎn)外地治療4例，2例死于嚴(yán)重感染。剩余96例患者中，40例化療后1個療程時，BMMNC-HSP27相對表達率小于1,56例BMMNC-HSP27相對表達率大于1。此96例患者隨訪時間為6～24個月，中位隨訪時間為15個月。隨訪觀察至2014年3月1日結(jié)束。BMMNC-HSP27相對表達率大于1組中有10例患者死亡，病死率為17.85%；BMMNC-HSP27相對表達率小于1組中，2例患者死亡，病死率為5.00%，后者的病死率明顯低于前者(P<0.05)。BMMNC-HSP27相對表達率大于1組中有23例患者復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為46.00%，復(fù)發(fā)時間為化療后(94±20)d；BMMNC-HSP27相對表達率小于1組中有8例患者復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為20.00%，復(fù)發(fā)時間為化療后(155±23)d，后者的復(fù)發(fā)率明顯低于前者(P<0.05)，且復(fù)發(fā)時間明顯高于前者(P<0.05)。

3 討 論

HSP27存在于所有活體細(xì)胞表面，其細(xì)胞保護作用可阻止應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞所致的細(xì)胞凋亡[10-12]。然而，一系列的既往研究證實HSP27的過度表達往往在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移中起促進作用[13]。諸多文獻雖證實HSP27的過度表達往往與MM的耐藥相關(guān)，且阻滯HSP的表達后，MM的耐藥突變可被逆轉(zhuǎn)[14]，但尚無動物及臨床試驗報道。其原因可能為：(1)惡性漿細(xì)胞的非均一分布所致的樣本漿細(xì)胞比例相差較大，且骨髓單個核細(xì)胞中漿細(xì)胞比例極低；(2)對于治療有效的病例，骨髓中漿細(xì)胞逐漸下降甚至消失，在此背景下，鑒于分組、時間點不同，所得單個核細(xì)胞中的成分區(qū)別巨大，如仍按照體外研究的模式將研究對象界定于MM細(xì)胞，即使使用流式細(xì)胞儀等技術(shù)對標(biāo)本進行純化，亦無法保證不同人群及不同時間點的骨髓瘤細(xì)胞HSP27表達一定具有可比性。

與體外研究不同，本研究選用BMMNC作為研究對象以評估HSP表達與MM臨床特征、療效、預(yù)后的相關(guān)性。研究證實骨髓漿細(xì)胞比例并不影響B(tài)MMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平，在不同骨髓漿細(xì)胞比例組中，初治組及復(fù)發(fā)難治組的mRNA表達及蛋白水平均存在差異，該結(jié)果表明MM細(xì)胞水平的變化并不足以影響總體BMMNC-HSP的表達及蛋白水平。進一步的分析表明BMMNC-HSP27的表達與分型無關(guān)，而與分期相關(guān)。此外，對BMMNC-HSP27表達量及蛋白水平的持續(xù)監(jiān)測證實含硼替佐米的化療方案可明顯降低HSP27的表達及蛋白水平，且抑制BMMNC-HSP27的表達力度明顯優(yōu)于常規(guī)化療組。治療狀態(tài)的比較證實初治患者中，BMMNC-HSP27表達及蛋白水平明顯降低，且可一直維持相對較低狀態(tài)。而復(fù)發(fā)難治的常規(guī)化療患者，BMMNC-HSP27表達無明顯改變。即使加用硼替佐米后，BMMNC-HSP27的表達量及蛋白水平略微下降，但仍低于初治硼替佐米化療組的患者下降幅度。該結(jié)果表明化療后BMMNC的HSP27表達量及蛋白水平可用于監(jiān)測治療應(yīng)答。而對預(yù)后的判定則證實BMMNC-HSP27與復(fù)發(fā)率、復(fù)發(fā)時間、死亡率相關(guān)。本研究結(jié)果表明化療后1個療程BMMNC-HSP27的表達量小于1的患者，其病死率、復(fù)發(fā)率明顯低于BMMNC-HSP27表達量大于1的患者，且復(fù)發(fā)時間明顯延后。

本研究的意義在于證實BMMNC-HSP27的表達對于MM的診療及預(yù)后評估有一定的監(jiān)測意義。將HSP27作為治療靶點或可改善MM的療效，并對新藥物、新化療方案的設(shè)定、論證起一定的輔助證明作用。本研究中，含硼替佐米的化療方案無論對于初治、還是復(fù)發(fā)難治的患者均可明顯降低HSP27的表達及蛋白水平，提示硼替佐米或可通過下調(diào)HSP27的表達，促進MM細(xì)胞的凋亡。

[1]Acunzo J,Katsogiannou M,Rocchi P.Small heat shock proteins HSP27(HspB1),αB-crystallin(HspB5) and HSP22(HspB8) as regulators of cell death[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(10):1622-1631.

[2]Mcconnell JR,Mcalpine SR.Heat shock proteins 27,40,and 70 as combinational and dual therapeutic cancer targets[J].Bioorg Med Chem Lett,2013,23(7):1923-1928.

[3]Zoubeidi A,Gleave M.Small heat shock proteins in cancer therapy and prognosis[J].Intern J Biochem Cell Biol,2012,44(10):1646-1656.

[4]Khalil AA,Kabapy NF,Deraz SF,et al.Heat shock proteins in oncology:Diagnostic biomarkers or therapeutic targets?[J].BBA-Reviews on Cancer,2011,1816(2):89-104.

[5]Yasui H,Hideshima T,Ikeda H,et al.BIRB 796 enhances cytotoxicity triggered by bortezomib,heat shock protein(Hsp) 90 inhibitor,and dexamethasone via inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase/Hsp27 pathway in multiple myeloma cell lines and inhibits paracrine tumour growth[J].Br J Haematol,2007,136(3):414-423.

[6]Navas TA,Nguyen AN,Hideshima T,et al.Inhibition of p38alpha MAPK enhances proteasome inhibitor-induced apoptosis of myeloma cells by modulating Hsp27,Bcl-X(L),Mcl-1 and p53 levels in vitro and inhibits tumor growth in vivo[J].Leukemia,2006,20(6):1017-1027.

[7]Chauhan D,Li G,Auclair D,et al.2-Methoxyestardiol and bortezomib/proteasome-inhibitor overcome dexamethasone-resistance in multiple myeloma cells by modulating Heat Shock Protein-27[J].Apoptosis,2004,9(2):149-155.

[8]Chauhan D,Li G,Shringarpure R,et al.Blockade of Hsp27 overcomes Bortezomib/proteasome inhibitor PS-341 resistance in lymphoma cells[J].Cancer Res,2003,63(19):6174-6177.

[9]Tsai JR,Liu PL,Chen YH,et al.Ginkgo biloba extract decreases non-small cell lung cancer cell migration by downregulating metastasis-associated factor heat-shock protein 27[J].PLoS One,2014,9(3):e91331.

[10]Katsogiannou M,Andrieu C,Rocchi P.Heat shock protein 27 phosphorylation state is associated with cancer progression[J].Front Genet,2014,5:346.

[11]Zhang L,Fok JH,Davies FE.Heat shock proteins in multiple myeloma[J].Oncotarget,2014,5(5):1132-1148.

[12]Vidyasagar A,Wilson NA,Djamali A.Heat shock protein 27 (HSP27):biomarker of disease and therapeutic target[J].Fibrogenesis Tissue Repair,2012,5(1):7.

[13]Jego G,Hazoumé A,Seigneuric R,et al.Targeting heat shock proteins in cancer[J].Cancer Lett,2013,332(2):275-285.

[14]Chauhan D,Li G,Hideshima T,et al.Hsp27 inhibits release of mitochondrial protein Smac in multiple myeloma cells and confers dexamethasone resistance[J].Blood,2003,102(9):3379-3386.

The clinical value of HSP27 expression of bone marrow mononuclear cells in multiple myeloma*

WangQing1,ZhangMeifang2,GuoXiaoli1,WangLianghong3,SongJun1,YuanBin4,ChenChi5,GuoPengxiang1，ZhuHongqian1

(1.DepartmentofHematology,thePeople′sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang,Guizhou550001,China；2.DepartmentofInternalMedicine,thePeople′sHospitalofXinleCity,XinLe,Hebei050700，China；3.ImmunologyTeachingandResearchSection,GuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004，China；4.DepartmentofHematology,CancerHospitalofGuizhouProvince,Guiyang,Guizhou550000，China；5.ImmunologyTeachingandResearchSection,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine，Guiyang,Guizhou550001，China)

Objective To investigate the relationship of HSP27 expression with treatment response,remission rate,prognosis in multiple myeloma(MM) patients.MethodsEighty-six patients with MM first diagnosis and 27 relapse cases were collected respectively.Control was defined as non-hematological malignance.The MM patients divided into first diagnosis,relapse conventional chemotherapy group and bortezomib group.HSP27 expression and protein level were measured on pre-and post 1,2 and 3 treatment circles.ResultsThe tendency of HSP expression and protein level:relapse-MM patients>first-diagnosis MM patients>control.HSP27 expression and level in Ⅲ phase was higher than those in Ⅱ phase for first-diagnosis MM patients.Bortizomib-containing chemotherapy protocol showed more effectively decrease on HSP27 than chemotherapy treatment only.At post-1 treatment circle,HSP27<1 showed higher survival rate than HSP27>1 and delayed the relapse time.ConclusionBMMNC-HSP27 expression and protein level is associated with staging,treatment response and prognosis in MM patients.

multiple myeloma;heat-shock proteins;prognosis;treatment response

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.015

貴州省聯(lián)合基金資助項目(黔科合SY[2010]3127號)。

：王清(1972-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究。

R559

A

1671-8348(2015)35-4946-04

2015-06-20

2015-08-18)