響應(yīng)面法優(yōu)化火棘總酚含量測(cè)定方法

張 煥，董光耀，舒 暢，王俊杰，陳西喆，鄢又玉*

1武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023;2 湖北神農(nóng)蜂語生物產(chǎn)業(yè)有限公司，十堰 442000

火棘［Pyracantha fortuneana (Maxim.)Li］為常綠灌木或小喬木，主產(chǎn)于川、滇、黔、陜、鄂、湘、粵、桂、閩、浙、皖、蘇等我國(guó)南方山區(qū)及丘陵地帶，資源極其豐富，目前已被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為食品新資源食用果品［1］。其果實(shí)富含多酚成分［2，3］，植物多酚具有抗氧化［4］、抗腫瘤，延緩衰老、免疫調(diào)節(jié)［5，6］等多種生物活性。

目前用于植物多酚的含量檢測(cè)方法較多，主要有分光光度法［7］、近紅外光譜法［8］以及色譜法［9，10］等。其中分光光度法因?qū)υO(shè)備的要求不高，操作簡(jiǎn)單而得到最廣泛應(yīng)用。主要包括酒石酸亞鐵比色法［11］、福林酚比色法［12］和高錳酸鉀滴定法［13］等，其中福林酚法應(yīng)用最為廣泛。但不同資料所報(bào)道的用于總酚測(cè)定的福林酚比色法檢測(cè)條件卻存在很大的差異［12，14-19］，主要表現(xiàn)在:①最大檢測(cè)波長(zhǎng)不一致，有以680、725、740、750、760、765、780 nm 等為測(cè)定波長(zhǎng);②福林酚試劑與堿液Na2CO3含量及比例各不相同，有1∶1、1∶2、1∶3 及1∶5 等;③Na2CO3溶液濃度差別很大，有5% (w/v)、7.5%、10%、15%、20%、飽和濃度等;④顯色時(shí)間分布在30～120 min等;⑤顯色溫度20～60 ℃不等。因此很有必要對(duì)影響福林酚顯色的因素進(jìn)行系統(tǒng)考察，以確定最優(yōu)檢測(cè)條件。目前對(duì)火棘中多酚化合物的定量測(cè)定方法尚未見報(bào)道。為了更好地開發(fā)利用火棘植物中的功效成分，本文通過響應(yīng)面優(yōu)化建立了福林酚比色法檢測(cè)火棘總酚含量的定量方法，此方法也可推廣應(yīng)用于其它植物總酚的含量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

Lambda 25 型紫外-可見光分光光度計(jì)(美國(guó)PE公司)，CR 22G 高速冷凍離心機(jī)(日本HATACHI 公司)，Molelement1018a 型摩爾超純水機(jī)(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)，萬分之一電子天平(德國(guó)賽多麗斯公司);高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);HSJ 系列恒溫水浴攪拌器(金壇市科析儀器有限公司);STARTER 2100 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)(奧豪斯儀器有限公司)。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110831-201403)，福林酚試劑(sigma 公司)，碳酸鈉、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

火棘果，2014 年11 月中旬采自湖北恩施來鳳地區(qū)，經(jīng)華中科技大學(xué)植物學(xué)博士楊悅鑒定為全緣火棘Pyracantha atalantioides 的果實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 火棘多酚提取物的制備

取干燥、粉碎過20 目篩的火棘果粉末20 g，加體積分?jǐn)?shù)45%乙醇200 mL 于92 ℃冷凝回流提取2 h，減壓抽濾，濾液定容于200 mL，濃度以火棘干物質(zhì)質(zhì)量計(jì)為100 g/L，離心，收集上清液0～4 ℃冷藏備用。

1.2.2 火棘多酚的測(cè)定

取1.2.1 中稀釋100 倍后的火棘多酚提取液1 mL，加入0.4 mol/L 福林酚試劑5 mL，混勻后，再加入170 g/L 的Na2CO3溶液1 mL，補(bǔ)充雙蒸水至總體積為10 mL，混勻(后續(xù)試驗(yàn)均依照此體系執(zhí)行)，于25 ℃避光恒溫水浴反應(yīng)1 h，冰水冷卻，室溫條件下于765 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

取適宜濃度的火棘多酚提取液及沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，參照1.2.2 顯色反應(yīng)后，室溫條件下于200～900 nm 全波段掃描，以確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4 反應(yīng)體系的確定

以10 μg/mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL 作為研究對(duì)象，確定福林酚法檢測(cè)總酚含量的最佳反應(yīng)體系。分別考察了福林酚試劑的濃度(mol/L)及用量(mL)、Na2CO3溶液的濃度(g/L)及用量(mL)、水浴時(shí)間(min)及溫度(℃)對(duì)總酚含量測(cè)定的影響以及火棘總酚溶液體系pH 值及火棘總酚提取液中乙醇體積濃度(%)等因素對(duì)火棘總酚含量測(cè)定的影響。

影響火棘多酚含量測(cè)定的單因素考察

1.2.5 影響火棘多酚含量測(cè)定的單因素考察

在1.2.4 的基礎(chǔ)上，確定多酚檢測(cè)的反應(yīng)體系為V待測(cè)溶液∶V福林酚試劑∶V碳酸鈉溶液=1∶5∶1，以此反應(yīng)體積比為模板，繼續(xù)深入探討福林酚試劑及Na2CO3溶液的濃度、水浴時(shí)間及溫度、火棘總酚溶液體系pH 值及火棘總酚提取液中乙醇體積濃度對(duì)火棘多酚測(cè)定的具體影響。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在1.2.5 項(xiàng)的基礎(chǔ)上，以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定待測(cè)溶液及反應(yīng)體系，確定福林酚的濃度為0.4 mol/L，選擇對(duì)火棘多酚檢測(cè)影響顯著的3 個(gè)因素:水浴時(shí)間、水浴溫度及Na2CO3溶液的濃度，按照Box-Behnken 設(shè)計(jì)，具體見表1。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平及編碼值Table 1 Levels and factors of response surface tests

1.2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化得到火棘多酚含量檢測(cè)的最優(yōu)條件后，我們確定了沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及火棘多酚的工作曲線，并進(jìn)行重復(fù)性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率等方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

參照1.2.3 設(shè)計(jì)，結(jié)果表明火棘多酚提取液及沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液均在765 nm 處達(dá)到最大吸收，故可選765 nm 作為最大檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 反應(yīng)體系的確定

參照1.2.4 設(shè)計(jì)，結(jié)果分別見圖1(A～E)。

圖1 福林酚試劑的用量(A)及濃度(B)、Na2CO3溶液的用量(C)及濃度(D)、水浴時(shí)間及溫度(E)對(duì)火棘總酚含量測(cè)定的影響Fig.1 Effects of amount (A)and concentration (B)of Folin-Ciocalteu reagent，amount (C)and concentration (D)of Na2CO3，Incubation time and temperature (E)on total polyphenols of P.fortuneana

由圖1(A)可知，隨著福林酚用量的增加，吸光度逐漸增加，至福林酚體積5 mL 時(shí)達(dá)到最大，此后趨于平緩，因此，福林酚添加量選為5 mL。由圖1(B)可知，福林酚濃度增加時(shí)，吸光度逐漸升高，當(dāng)濃度超過0.2 mol/L 時(shí)增幅趨緩，故選擇福林酚濃度為0.2 mol/L 繼續(xù)研究。由圖1(C)及圖1(D)可知，隨著Na2CO3溶液體積及濃度的增加，吸光度先快速增加后趨于平緩，添加量為1.0 mL，濃度為150 g/ L 時(shí)達(dá)到最大，因此Na2CO3溶液添加量選為1.0 mL，濃度為150 g/ L。由圖1(E)可知，隨著水浴溫度的增加，吸光度先增后減，25 ℃時(shí)，達(dá)到最大值，當(dāng)溫度繼續(xù)增加時(shí)，體系穩(wěn)定性下降;隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度增幅緩慢，選水浴時(shí)間30～60 min較為合適。

2.3 影響火棘多酚含量測(cè)定的單因素考察

參照1.2.5 設(shè)計(jì)，結(jié)果見圖2(A～E)。

參照2.2 的分析，結(jié)合圖2(A～C)可知，在用于火棘多酚檢測(cè)時(shí)，福林酚濃度可調(diào)整至0.4 mol/L，Na2CO3溶液濃度可選擇200 g/L，水浴溫度選擇25 ℃，水浴時(shí)間60 min 較為合適。由圖2(D)可知，溶液體系的pH 對(duì)總酚含量的測(cè)定有一定影響，當(dāng)pH＜3 時(shí)，無顯著影響，3＜pH＜5 時(shí)，隨pH 增加，吸光度增加，5＜pH＜7 時(shí)，隨pH 增加，吸光度減小?？紤]到火棘酚類溶液呈酸性，在酸性條件下貯藏穩(wěn)定，因此只考察酸性條件對(duì)檢測(cè)的影響。工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，多酚的提取免不了使用乙醇為溶劑，由圖2(E)可知，待檢體系中乙醇的含量對(duì)多酚檢測(cè)有一定影響，隨著乙醇濃度的增加，吸光度先增后減，乙醇濃度為40 %時(shí)達(dá)到極值，進(jìn)一步增大乙醇濃度超過80 %時(shí)，待檢溶液出現(xiàn)渾濁，分析認(rèn)為是提取液中少量多糖醇沉析出或Na2CO3難溶入乙醇而析出。

圖2 福林酚試劑的濃度(A)、Na2CO3溶液的濃度(B)、水浴時(shí)間及溫度(C)、火棘總酚溶液體系pH 值(D)及火棘總酚提取液中乙醇體積濃度(E)對(duì)火棘總酚含量測(cè)定的影響.Fig.2 Effects of concentration of Folin-Ciocalteu reagent (A)，concentration of Na2CO3(B)，incubation time and temperature(C)，pH of total polyphenols solution from P.fortuneanna (D)and ethanol concentration of extraction solution from P.fortuneana (E)on total polyphenols of P.fortuneana

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

按照1.2.6 設(shè)計(jì)，具體結(jié)果參見表2。

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design and the results

利用Design-Expert 8.0.6 軟件，對(duì)表2 結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到三元二次回歸方程式:Y=0.30 +0.087 X1+5.25 ×10-3X2+0.013 X3-0.01 X1X2-9.5×10-3X1X3-4.75 ×10-3X2X3-0.07-7.9 ×10-53-9.65 ×10-3利用Design-Expert 8.0.6 軟件，進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析表Table 3 ANOVA of regression analysis

由表3 可知，X1、X3、項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響極顯著(P＜0.01)，X1X2項(xiàng)影響顯著(0.01＜P＜0.05)。判定系數(shù)R2=0.9941 說明模型顯著，相關(guān)性非常好，實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值有較大影響。校正判定系數(shù)=0.9865，表明98.65%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可以用此回歸模型解釋。變異系數(shù)CV=3.26%，說明實(shí)驗(yàn)的可信度及精確度較好。精確度＞4 視為合理，本實(shí)驗(yàn)精密度=31.256，表明符合要求。模型F值為131.30，表明該模型達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。此外，失擬項(xiàng)F 值為4.24(P=0.0985 ＞0.05)，說明失擬值和純誤差沒有顯著性關(guān)系，回歸模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域不失擬，該模型能用于指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

進(jìn)一步對(duì)模型進(jìn)行兩因素效應(yīng)分析，結(jié)果見圖3。

由圖3(A)可知，Na2CO3濃度與水浴時(shí)間交互作用顯著，吸光度隨Na2CO3濃度的增加呈現(xiàn)先快增后減緩的趨勢(shì)，在Na2CO3濃度為145 g/L 左右時(shí)達(dá)到極值，Na2CO3濃度對(duì)吸光度影響顯著。圖3(B)表明水浴時(shí)間與水浴溫度交互作用不顯著，相對(duì)而言，水浴溫度對(duì)吸光度的影響更顯著一些。圖3(C)表明，吸光度隨Na2CO3濃度的增加呈現(xiàn)先快增后減緩的趨勢(shì)，在Na2CO3濃度為160 g/L 左右時(shí)達(dá)到極值，相對(duì)而言，Na2CO3濃度對(duì)吸光度影響更顯著。

通過軟件(Design Expert 8.0.6)分析得到火棘多酚檢測(cè)的最適條件為Na2CO3濃度171 g/L、水浴時(shí)間40.43 min，水浴溫度33.97 ℃，在此條件下吸光度的預(yù)測(cè)值為0.3306。為了驗(yàn)證該響應(yīng)面結(jié)果的可行性，對(duì)所得最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在Na2CO3濃度170 g/L、水浴時(shí)間40 min，水浴溫度34 ℃條件下進(jìn)行5 次實(shí)驗(yàn)，所得吸光度分別為0.3253、0.3263、0.3243、0.3260、0.334，平均值為0.3277，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.495%，說明該條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.51%，說明該響應(yīng)面結(jié)果可靠。

2.5 測(cè)定方法評(píng)價(jià)

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系考察

圖3 火棘多酚含量測(cè)定響應(yīng)面及等高線圖Fig.3 Response surface plots and contour plots for the determination of polyphenols content from P.fortuneana

配制不同濃度(10、15、20、25、30、35 μg/mL)的沒食子酸溶液及火棘總酚提取液(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L)，按以上試驗(yàn)得出的最適條件顯色后，在765 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度，分別以沒食子酸及火棘總酚提取液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得到線性回歸方程為:Y=0.00111+0.01682X(R2=0.9983)，Y=0.04482+0.32057xX(R2=0.9965)。結(jié)果表明沒食子酸及火棘總酚提取液濃度分別在10～35 μg/mL 以及0.4～1.4 g/L 與吸光度線性關(guān)系良好。其中y 為吸光度，x 為濃度。

2.5.2 重復(fù)性考察

按已確定的最適條件，取火棘總酚濃度為0.4、1.4 g/L 樣品2 份，由同一分析人員在765 nm 波長(zhǎng)處平行測(cè)定5 次吸光度，記錄數(shù)據(jù)，求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)，結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 4 Repeatability tests of the determination results

表5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 5 Reproducibility tests of the determination results

由表4 可知，該方法測(cè)定2 份樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.00158 和0.00235，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.90%和0.47%，呈現(xiàn)出良好的重復(fù)性。

2.5.3 重現(xiàn)性考察

按已確定的最適條件，取火棘總酚濃度為0.4、1.4 g/L 樣品2 份，由不同實(shí)驗(yàn)室，不同分析人員在765 nm 波長(zhǎng)處平行測(cè)定5 次吸光度，記錄數(shù)據(jù)，求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)，結(jié)果見表5。

由表5 可知，該方法測(cè)定2 份樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.00230 和0.00239，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%和0.48%，呈現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性。

2.5.4 穩(wěn)定性考察

按已確定的最適條件，取火棘總酚濃度為0.4、1.4 g/L 樣品2 份，每隔10 min 在765 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6 次。記錄數(shù)據(jù)，求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)，結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 6 Stability tests of the determination results

由表6 可知，該方法測(cè)定2 份樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.0016 和0.0018，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%和0.36%，表明樣品在1 h 內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定。

2.5.5 加標(biāo)回收率測(cè)定

取5 份濃度為0.4 mg/mL 火棘總酚提取液1.0 mL，分別加入沒食子酸0.2 mg，按以上實(shí)驗(yàn)確定的最適條件，測(cè)定5 份樣品的吸光度并計(jì)算混合后的總酚含量。計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表7。

表7 沒食子酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 7 Recovery tests of gallic acid (n=5)

由表7 可知，該方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.12%，具有較高的回收率99.95%。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面優(yōu)化建立了福林酚比色法檢測(cè)火棘總酚含量的定量方法。結(jié)果表明，火棘總酚的最適檢測(cè)條件為:1 mL 適宜濃度的火棘總酚提取物，加入0.4 mol/L 福林酚試劑5 mL，漩渦混勻后，加入170 g/L Na2CO3溶液1 mL，混勻后于34 ℃水浴反應(yīng)40 min，冰水中快速冷卻，室溫條件下于765 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度。該方法具有極好的重復(fù)性及重現(xiàn)性，1 h 內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定性高，回收率高達(dá)99.95%，測(cè)定時(shí)雖然待測(cè)液體系pH 及乙醇濃度對(duì)吸光度有一定的影響，但因?yàn)榇龣z樣品液檢測(cè)時(shí)都被預(yù)先稀釋了很多倍或通過待檢體系得以稀釋，因此可忽略待測(cè)液體系pH 及乙醇濃度的影響。該方法可推廣應(yīng)用于其它植物總酚含量的檢測(cè)。

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