翼蓼塊根提取物的抗氧化活性和血管緊張素轉化酶抑制活性研究

王 蘭，郭利杰，許明錄

1河南師范大學，新鄉(xiāng) 453007;2 河南科技學院，新鄉(xiāng) 453003

研究發(fā)現(xiàn)人體內代謝產生的自由基不僅會引起衰老，還會引發(fā)很多疾病，如動脈硬化、糖尿病、白內障等［1］。這些疾病主要是自由基過氧化物的累積所致。人體內各種外源性和內源性自由基在一定外界環(huán)境下，與生物體內的許多物質如脂肪酸蛋白質等作用，奪取氫原子，從而使相關細胞的結構與功能遭到破壞。雖然目前一些人工合成的抗氧化劑具有一定的抗氧化效果，但是其安全性卻遭到了質疑，所以研究具有抗氧化能力的安全有效天然產物已經成為了當今研究的熱點。

高血壓是最常見的心血管病，患高血壓疾病的人數(shù)在全球呈增長趨勢，是全球范圍內的重大公共衛(wèi)生問題。血管緊張素轉化酶(ACE)是將血管緊張素I 轉化為血管緊張素II 的重要的酶，血管緊張素II 能引起血管收縮，升高血壓;促進腎上腺皮質釋放醛固酮，所以抑制ACE 的活性可以直接預防高血壓［2］。近年來人們從天然產物中分離出許多血管緊張素轉化酶抑制肽，其降壓效果雖然不如合成的藥物，但是其對正常血壓無影響的特點和天然來源的安全性使之成為人們治療高血壓的一個新的方向。因此，從天然物種中分離純化藥物毒副作用小、療效更好的代替藥物的研究勢在必行。

翼蓼(Pteroxygonum giraldii Dammer et Diels)為蓼科翼蓼屬的單種，是我國的特有物種。翼蓼主要產地為河北、山西、河南、陜西、甘肅、湖北及四川。生長在山坡石縫，山谷灌叢中。翼蓼的塊根俗稱“蕎麥七”，是陜西七藥的一種。在傳統(tǒng)中藥理論中，翼蓼具有清熱解毒、涼血止血、止痛的功效，主要用治療腸胃炎、痢疾、吐血、便血，崩帶漏下、燒燙傷等癥。近期研究發(fā)現(xiàn)，從翼蓼的塊根中分離得到的化合物有黃酮、酚酸、三萜等類化合物［3，4］。有研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有不容忽視的抗氧化能力，對于一些因氧自由基損傷所引起的疾病可能有治療價值。酚酸類化合物是指同一苯環(huán)上有若干個酚性羥基的一類化合物，酚酸類物質均有不同程度的清除自由基作用，是一類良好的天然抗氧化劑［5］。三萜類化合物是一類重要的天然抗氧化活性物質，具有較高的研究和應用價值。自然界中不斷發(fā)現(xiàn)黃酮類物質具有降血壓、調血脂作用，如銀杏葉中的黃酮類物質可以抑制血管緊張素酶［6］、醋柳黃酮對兔血漿血管緊張素酶活性和血管緊張素I 具有顯著抑制作用［7］，目前尚沒有發(fā)現(xiàn)翼蓼提取物具有ACE 抑制活性相關的報道。

本文以翼蓼塊根為實驗材料，主要對翼蓼塊根甲醇提取物及乙酸乙酯、水、正丁醇萃取物的總酚、總黃酮含量，以及DPPH 自由基清除能力、金屬離子螯合能力、還原能力，以及不同提取物的ACE 抑制活性等進行了分析，并就天然產物的總酚、總黃酮含量與抗氧化活性，以及抗氧化活性與ACE 的抑制活性做了初步探究，從而試圖為天然藥物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:翼蓼塊根于2010 年10 月采于河南省太行山，經河南科技學院生命科技學院許桂芳教授鑒定。

試劑:Folin-Denis、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigma 公司產品)、Ferrozine 試劑(5 mmol/L)、血管緊張素轉換酶(ACE)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hip-HIS-Leu，HHL)。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取與萃取

將干燥的翼蓼塊根(0.5 kg)粉末盛裝于10 L廣口瓶內，用3 L 甲醇浸提，60 ℃恒溫水浴鍋，加熱回流提取24 h。提取液用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮蒸干，以上過程重復三次，合并三次提取物得到翼蓼塊根的甲醇提取物(PGM)48.6 g。再用蒸餾水將翼蓼塊根的甲醇提取物溶解，然后依次使用正己烷(Hexane，H)、二氯甲烷(Methylene chloride，Mc)、乙酸乙酯(Ethyl acetate，E)、正丁醇(Butanol，B)的順序按1∶1 的比例進行萃取，每種溶劑萃取三次，最后得到水(Water，W)層。各提取液用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮蒸干，得到各萃取層的量為:正己烷層(PGH，0.34 g)、二氯甲烷層(PGMc，2.27 g)、乙酸乙酯層(PGE，24.51 g)、正丁醇層(PGB，19.37 g)和水層(PGW，11.92 g)。各提取物溶解稀釋后備下列實驗使用。

1.2.2 總酚含量測定

總酚含量測定方法根據(jù)Ragazzi 等［8］描述，略做修改。在小試管中分別加入樣品(1000 μg/mL)1mL+Folin-Denis 試劑2 mL，5 min 后，再加入Na2CO3飽和溶液2 mL，充分混合，在室溫下反應30 min，并做三組重復。對照組中的樣品用蒸餾水代替，其它條件不變?？瞻捉M中Folin-Denis 試劑用蒸餾水代替，其它條件不變，在波長725 nm 處測定吸光度值。

以每克樣品中含沒食子酸的毫克數(shù)表示總酚含量:

1.2.3 總黃酮含量測定

總黃酮含量測定的方法參考Park 等［9］的描述。在小試管中分別加入樣品(1000 μg/mL)0.5 mL，1 mmol/L CH3COOK 溶液0.1 mL，2.8 mL 蒸餾水，95%乙醇1.5 mL，和10% AlCl3·6H2O 溶液0.1 mL。對照組中樣品和AlCl3·6H2O 溶液用蒸餾水代替，其它條件不變?？瞻捉M中AlCl3·6H2O 溶液用蒸餾水代替，其它條件不變。所配溶液在室溫下放置40 min 在415 nm 下測定吸光度值。做三組重復。

以每克樣品中含槲皮素的毫克數(shù)表示總黃酮含量:

1.2.4 DPPH 自由基清除能力的測定

DPPH 自由基的清除能力測定依據(jù)Yen 和Chen(1995)［10］的方法，略做修改。在對照組內加入0.75 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液+0.75 mL蒸餾水，在實驗組內加入0.75 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液+0.75 mL 待測樣品溶液，在空白組內加入:0.75 mL 待測樣品溶液+0.75 mL 甲醇溶液，混合均勻后于室溫下在暗處靜置30 min，然后在517 nm 處測定吸光度值。

待測樣品對DPPH 自由基的清除能力:

其中:Ao為對照組的吸光度;Ai為實驗組的吸光度;Aj為空白組的吸光度。

本實驗中將各層待測樣品分別配制成0.1、1、10、100 μg/mL 的一系列濃度梯度的溶液，然后配制對照組、實驗組、空白組，最后測定對應待測樣品濃度的吸光度，每個樣品的每個濃度重復3 次。計算DPPH 自由基清除率和不同層樣品對DPPH 自由基清除能力的EC50值。實驗中以抗壞血酸和BHA 的EC50值作為對照來研究其DPPH 自由基清除能力。

1.2.5 亞鐵離子螯合作用

金屬離子螯合實驗方法根據(jù)Dinis 等［11］所述。將各層樣品配制成一定濃度梯度溶液，取待測樣品1 mL，依次加入80% 乙醇0.8 mL，2 mmol/L 的FeCl2·4H2O 0.1 mL，5 mmol/L 的Ferrozine 試劑0.1 mL，在室溫下反應10 min 后在562 nm 下測吸光度值。對照組待測樣品用乙醇代替，其他條件不變。螯合作用按下式計算:

其中:As為待測溶液的吸光度;Ao為對照組溶液的吸光度。實驗中用50 μg/mL 的EDTA 的螯合作用作對照。

1.2.6 還原能力測定

還原力測定方法依據(jù)Singh 和Rajini［12］所述。將各層配制成一系列濃度梯度的溶液，分別移取各濃度的待測樣品0.2 mL 于試管中，加入磷酸緩沖液(pH 6.6)0.5 mL，再加入1%鐵氰化鉀溶液0.5 mL，在50 ℃下反應30 min。然后加入10% 三氯乙酸溶液0.5 mL 充分混和均勻，3000 rpm 下離心10 min。移取上清液0.5 mL 于試管中，加入0.5 mL 蒸餾水，再加入0.1% 三氯化鐵0.1 mL，常溫下反應5 min，然后使用紫外可見分光光度計于700 nm 波長下測定吸光度值。同時做對照組，將0.2 mL 的待測樣品用蒸餾水代替，其他條件不變。

根據(jù)各反應組吸光度值的大小評價翼蓼塊根各層的抗氧化能力，吸光度值越高表示還原能力越強。

1.2.7 ACE 活性抑制率測定

ACE 活性抑制實驗方法根據(jù)Serra［13］所述，略做修改。分別將PGM、PGW、PGB、PGE 配制成濃度為1000 μg/mL 和500 μg/mL 的溶液。在2 mL 的離心管中加入50 μL 待測樣品溶液和200 μL 5 mmol HHL (含有0.3 mol/L pH 8.3 硼酸鹽緩沖液)。在37 ℃下恒溫水浴5 min，然后加入50 μL 0.4 U/mL ACE 啟動反應，繼續(xù)在37 ℃恒溫保持30 min，然后加入0.2 mL 1 mol/L 的HCl 終止反應，再加入1.2 mL 冰冷的乙酸乙酯，用力振蕩混勻后在3500 rpm 下離心5 min，取出0.8 mL 酯層移入試管中，85 ℃烘干1 h，加入4 mL 的蒸餾水振蕩2 min 溶解馬尿酸，在228 nm 下測定吸光度值。對照組不加入待測樣品溶液，空白組在反應前先加入0.2 mL 1 mol/L 的HCl 以終止反應，其他條件不變。同等條件下以100 μg/mL 卡托普利(Captopril)為陽性參考物。根據(jù)吸光度值計算出ACE 的抑制率。ACE 抑制率計算公式如下:

其中:Ao為對照組的吸光度;Ai為實驗組的吸光度;Aj為空白組的吸光度。

2 結果與討論

2.1 總酚與總黃酮含量測定結果及分析

將各層待測樣品配制成濃度為1000 μg/mL 的溶液，分別測定其在725 nm 處和在415 nm 處的吸光度。結果表明各層總酚含量和總黃酮含量均存在一定差異(如表1)。翼蓼各層總酚含量以沒食子酸等效物表示，結果表明:PGE 層總酚含量最高，PGW層含量次之，PGM 層含量最少;總黃酮的含量以槲皮素等效物表示，結果表明:PGE 層總黃酮含量相對較高，PGB 層含量最少。

表1 不同提取物的總酚含量、總黃酮含量及清除DPPH 自由基的EC50值Table 1 The total phenol and flavonoid content of four extracts and the EC50value of DPPH· scavenging tests

2.2 DPPH 自由基清除能力的測定結果及分析

對各層待測樣品的DPPH 自由基清除率的測定結果(如圖1)、EC50值(表1)進行對比分析，可反映其抗氧化活性方面的價值。各層的DPPH 自由基清除能力總體上均隨濃度增加而增強，但隨濃度變化的趨勢不同。低濃度時，PGM、PGW、PGB 隨濃度增加，清除率變化不明顯，而PGE 在低濃度時就有很大清除率，從10 μg/mL 到100 μg/mL，增長均在100%以上。EC50值越小，其抗氧化活性越強。各層的EC50值表明:PGE 萃取物的EC50值最小，抗氧化活性能力最強，PGB、PGW、PGW 抗氧化活性能力依次減弱。作為對照的抗氧化劑L-Ascorbic acid 和BHA 的EC50值分別是13.18 μg/mL 和12.75 μg/mL。而PGE 層的EC50值為11.43 μg/mL，低于所選取的標準品，說明該層具有較好的DPPH 自由基清除能力?？傮w上來說，以上各層的DPPH 自由基清除能力都很強，有很重要的研究價值。

2.3 亞鐵離子螯合作用結果及分析

圖1 翼蓼塊根不同溶劑提取物的DPPH 自由基清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging activity of the different extracts from P.giraldii root

圖2 翼蓼塊根的不同溶劑提取物的亞鐵離子螯合作用Fig.2 Ferrous ion chelating effects of methanol extract and its solvent fractions of P.giraldii and positive control EDTA

翼蓼塊根的甲醇提取物和各有機溶劑組分的Fe2+螯合作用數(shù)據(jù)如圖2 所示，隨著濃度增加(50、100、500、1000 μg/mL)，螯合作用增強，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。其中，當濃度為100 μg/mL 時，PGE的螯合作用為31.01%，由數(shù)據(jù)可以看出翼蓼(PG)根的PGE 層具有最強的Fe2+螯合作用。然而，對比抗氧化劑EDTA(50 μg/mL)的64.35%的螯合作用明顯較低。

2.4 還原能力測定結果及分析

吸光度值的高低可以間接反應抗氧化劑還原能力的大?。?］。由圖3 可以看出，各層的吸光度值均隨其濃度增加而增大，因此其還原能力也隨其濃度增加而增強。同廣泛使用的相應濃度的抗氧化劑BHA 對比分析可以看出，各層均表現(xiàn)出較好的還原能力，具有較強的抗氧化活性。

圖3 翼蓼塊根的不同溶劑提取物的還原力測定Fig.3 Reducing power of methanol extract and its solvent fractions of P.giraldii and BHA

2.5 ACE 抑制率測定結果及分析

實驗結果顯示，當待測樣品濃度為1000 μg/mL和500 μg/mL 時，ACE 抑制率分別為(如圖4 所示):PGE 為39.76%和35.37%，PGM 為39.45%和20.80%，PGB 為35.47%和32.21%，而標準品卡托普利(100 μg/mL)的抑制率為41.96%。對比數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，當濃度為1000 μg/mL 時，PGE 和PGM 的抑制活性最好，接近標準品。

圖4 翼蓼塊根不同溶劑提取物的ACE 抑制活性Fig.4 ACE inhibitory activity of methanol extract and its solvent fractions of P.giraldii

3 結論

通過數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn):翼蓼塊根的總酚和總黃酮含量與其抗氧化活性呈正相關，在PGE 層表現(xiàn)尤為明顯，其DPPH 自由基清除能力最強，金屬離子螯合能力和還原能力也均比其它層強，與總酚和類酮含量呈現(xiàn)出明顯的正相關，PGE 層的ACE 抑制活性略高于PGM 層，這與它們具有接近的類黃酮含量相關。究竟ACE 抑制活性與提取物中的抗氧化成分二者間的作用機理，尚需要進一步的研究和闡述，特別是PGE 層，富含黃酮類物質，其抑制ACE 活性與黃酮類成分的關系，均值得進一步研究。

本實驗通過體外評價的方法，從不同的角度初步評估了翼蓼塊根提取物體外抗氧化的能力，并研究了其抑制ACE 活性的能力，初步判斷了抗氧化能力與抑制ACE 活性及總酚、總黃酮含量含量的相關性，但是，在翼蓼塊根提取物中起到抑制ACE 活性的黃酮類化合物成分，還需要在活性實驗的指導下，進一步分離純化。該實驗結果為今后活性化合物的研究與開發(fā)提供了理論依據(jù)和基礎。

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