微波處理對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)及功能性的影響

郝天舒，王長(zhǎng)遠(yuǎn)

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319

米糠蛋白的必需氨基酸完全，氨基酸組成接近FAO/WHO 的推薦模式;米糠蛋白中賴氨酸含量高于大米胚乳、小麥面粉以及其它谷物，生物效價(jià)與牛奶中的酪蛋白相近，消化率達(dá)90%以上，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的植物蛋白。另外，由于其具有低過敏性的特點(diǎn)，故可在嬰幼兒食品中應(yīng)用［1-3］。盡管米糠蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，但米糠蛋白的有效提取及功能性發(fā)揮相對(duì)受制，因而現(xiàn)今的研究多圍繞增進(jìn)米糠蛋白提取率及合理米糠蛋白改性展開。其中微波技術(shù)是一種米糠蛋白輔助增溶及提高制取率的常用技術(shù)，但目前對(duì)此技術(shù)的研究多集中在以提高得率為目標(biāo)的提取工藝上，對(duì)于微波處理下米糠蛋白結(jié)構(gòu)特征及功能性的變化研究尚未見報(bào)道。

目前，在蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究中，由于受到分散介質(zhì)的影響，較多結(jié)構(gòu)分析儀器無法完成正常測(cè)定或受到一定測(cè)定影響，由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光譜是研究水溶液中的生物樣品和化學(xué)化合物的理想工具。從蛋白質(zhì)的拉曼光譜可以得到有關(guān)它的芳香族組成氨基酸的信息，還能進(jìn)一步得到二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。有關(guān)利用拉曼光譜分析多肽及蛋白質(zhì)構(gòu)型的研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道［4-7］。

本研究擬采用拉曼光譜研究微波處理對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并探究了微波處理對(duì)米糠蛋白功能性的影響，以期通過結(jié)構(gòu)變化的辨認(rèn)為探清微波處理下米糠蛋白功能性改良提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:米糠蛋白，由實(shí)驗(yàn)室制備(米糠蛋白蛋白含量為89.21%);其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器:格蘭仕WP800TL23-K3 微波爐，格蘭仕集團(tuán);PE Raman Station 400 激光顯微拉曼光譜儀，美國(guó)PE 公司;TD5A-WS 臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠蛋白的制備及微波處理

將新鮮粗米糠(蛋白質(zhì)含量約為14.0%)，經(jīng)60 目篩除雜質(zhì)，向過篩米糠中以1∶6 的比例加入正己烷，室溫下攪拌2 h，然后停止攪拌靜止5 min 將上清液倒入回收瓶待回收，再用料液比為1∶4 的比例加入正己烷繼續(xù)攪拌2 h，4000 rpm 離心5 min，沉淀在通風(fēng)櫥中室溫風(fēng)干，制得脫脂米糠備用。

脫脂米糠100 g，按料液比1∶10 加入1000 mL水，用NaOH 溶液調(diào)pH 至9，45 ℃下恒溫水浴攪拌2 h，4000 rpm 下離心20 min，收集上清液，調(diào)節(jié)pH至4.5，靜止沉淀后4000 rpm 離心15 min，傾去上清液，沉淀于4 ℃對(duì)蒸餾水透析48 h，沉淀真空冷凍干燥，即為米糠蛋白粉，所制備的米糠蛋白粉經(jīng)DE-52纖維素陰離子交換層析初步純化后，利用Sephadex G-75 凝膠過濾層析柱再次純化。純化后樣品凍干并于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)測(cè)定，所制備的米糠蛋白蛋白含量為89.21%。

將米糠蛋白溶解在pH 7.4、10 mM 的磷酸緩沖液(標(biāo)準(zhǔn)緩沖液)中，磁力攪拌2 h 配制成濃度為3%的米糠蛋白溶液。4000 rpm 離心10 min 除去不溶物，以用作儲(chǔ)備液。然后將儲(chǔ)備液用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液稀釋分裝在三角瓶中，用軟膠塞塞住瓶口避免水分蒸發(fā)。

將充分水合的米糠蛋白液置于微波爐物料倉(cāng)中，調(diào)整微波爐的功率輸出分別為136、296、528、680、800 W，設(shè)置加熱時(shí)間為5 min。微波處理結(jié)束后將米糠蛋白液冷卻、凍干，留樣待測(cè)。對(duì)應(yīng)于微波功率136、296、528、680、800 W，處理后的米糠蛋白液溫度分別為90、90、92、100、102 ℃，將微波處理后的米糠蛋白樣品分別記為W-1、W-2、W-3、W-4、W-5;未經(jīng)微波處理的米糠蛋白作為對(duì)照樣品，記為RBP。

1.2.2 拉曼光譜分析

將米糠分離蛋白分散在相應(yīng)的pH 緩沖液中配制成100 mg/mL 溶液進(jìn)行拉曼實(shí)驗(yàn)，激發(fā)光波長(zhǎng)785 nm，發(fā)射功率300 mW，測(cè)量拉曼譜范圍為400～2000 cm-1。每個(gè)樣品都重復(fù)掃描3 次以上，各樣品的拉曼譜圖都由計(jì)算機(jī)做信號(hào)累加平均并繪圖輸出，峰位誤差小于±3 cm-1。

拉曼圖譜基線校正、歸屬采用OMINIC 軟件，歸一化處理以苯丙氨酸的1003 cm-1為內(nèi)標(biāo)，以此作為各拉曼峰強(qiáng)度變化的依據(jù)，譜圖的擬合采用Origin 8.0 軟件。

1.2.3 溶解性

蛋白的溶解性以氮溶指數(shù)表示。精確稱取2.00 g 蛋白樣品，溶解于45 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 至7.0，室溫下攪拌1 h 后，在4000 rpm 下離心20 min除去沉淀，測(cè)定上清液中的氮含量。

1.2.4 乳化及乳化穩(wěn)定性

微波處理后米糠蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)試方法參照Agyare 等［8］。準(zhǔn)確稱取1.00 g 樣品，加入到0.05 mol/L，pH 7.0 的磷酸緩沖液中，配置成1%的蛋白溶液100 mL，使之充分溶解。取75 mL蛋白溶液與25 mL 大豆油充分混合，在高速剪切乳化機(jī)下10000 rpm 乳化2 min，然后立刻在0 min 燒杯底部吸取20 μL 乳狀液，加入至5 mL 0.1%的SDS 溶液中混合均勻，使之稀釋250 倍。以濃度為0.1%的SDS 溶液為空白樣品，測(cè)定500 nm 下的吸光值。按下面公式計(jì)算乳化活性EAI。

其中:T=2.303;N 為稀釋倍數(shù)，250;c 為乳化液未形成前蛋白質(zhì)溶液的濃度(g/mL);Φ 為乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)，0.25;A0為0 min 時(shí)的吸光值。

測(cè)定蛋白的乳化穩(wěn)定性，則待乳化液放置10 min 后，再?gòu)臒撞课∪闋钜?一定要與0 min取樣點(diǎn)的高度相同)，按如上方法測(cè)定吸光值。按下面公式計(jì)算乳化穩(wěn)定性ES。

其中:A0為0 min 時(shí)的吸光值;A10為10 min 時(shí)的吸光值;t 為間隔時(shí)間，10 min。

1.2.5 起泡及起泡穩(wěn)定性

微波處理后米糠蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性測(cè)試方法參照Agyare 等［8］。將蛋白樣品取一定量加入到0.01 mol/L 的pH 7.0 磷酸緩沖液中，配置成5%蛋白溶液，取200 mL 樣品，在高速均質(zhì)機(jī)下以10000 rpm，攪打2 min，快速移至500 mL 量筒中，記錄0 min，15 min 泡沫的高度，表示蛋白起泡能力的大小，并進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)。按如下公式計(jì)算:

其中，H 為未攪打時(shí)溶液的高度，cm;H0為攪打停止時(shí)泡沫的高度，cm。

其中，H15為攪打停止靜置15 min 時(shí)泡沫的高度，cm。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用SPSS19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，其他數(shù)據(jù)擬合處理采用Origin8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)影響的拉曼分析

圖1 不同微波處理?xiàng)l件下米糠蛋白的拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectra of rice bran protein under different conditions

圖1 所示為不同拉曼處理?xiàng)l件下米糠蛋白的拉曼光譜圖，譜線以苯丙氨酸在1003 cm-1處的拉曼歸屬峰作為內(nèi)標(biāo)，利用OMINIC 軟件歸一化處理，在此基礎(chǔ)上計(jì)算了不同微波處理?xiàng)l件下米糠蛋白中各個(gè)基團(tuán)的譜線強(qiáng)度的變化率。此后采用Orgin8.0 軟件進(jìn)行分峰指認(rèn)及平滑處理，最終擬合結(jié)果如圖1所示。

2.1.1 微波處理對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的拉曼分析

為確定米糠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成在超聲處理下的變化，試驗(yàn)采用OMINIC 軟件對(duì)米糠蛋白拉曼光譜的酰胺I 區(qū)進(jìn)行解析，經(jīng)整合現(xiàn)有文獻(xiàn)得知蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的拉曼峰位歸屬為［9］:α-螺旋結(jié)構(gòu)1645～1660 cm-1;β-折疊結(jié)構(gòu)1665～1680 cm-1;β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)1680～1690 cm-1;無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)1660～1670 cm-1，進(jìn)一步分析得到相應(yīng)結(jié)果如表1 所示。

表1 利用酰胺Ⅰ帶擬合米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成結(jié)果Table 1 Secondary structure of rice bran protein fitted by amide I

由表1 可知，未經(jīng)微波處理的米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成主要為β-折疊構(gòu)象，α-螺旋結(jié)構(gòu)及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量次之，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量最少。相比于未處理的米糠蛋白，微波處理總體降低了米糠蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)含量，但增加了β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量。

隨著微波強(qiáng)度的增大，米糠蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)均呈先降低后增加的變化趨勢(shì)，而β-折疊結(jié)構(gòu)含量總體呈降低趨勢(shì)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量則呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。

2.1.2 微波處理對(duì)米糠蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu)影響的拉曼分析

850 cm-1和830 cm-1是酪氨酸殘基的苯環(huán)的呼吸振動(dòng)和面外彎曲倍頻之間的費(fèi)米共振［10］，通過公式(1)可進(jìn)一步精確地表征酪氨酸分子暴露與包埋數(shù)［11］。

通過公式計(jì)算，酪氨酸分子暴露與包埋數(shù)比值如表2，由表2 可知未微波處理的米糠蛋白其酪氨酸主要呈現(xiàn)暴露態(tài)，總體而言，微波處理后酪氨酸的暴露分子數(shù)呈現(xiàn)微量增加，但微波功率強(qiáng)度的增加并未顯著影響酪氨酸分子的分布狀態(tài)。

表2 酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830及殘基暴露與包埋分子數(shù)Table 2 Ratio of the intensity of the Fermi-resonance doublet of tyrosine and the number of exposed and the buried tyrosines per molecules

756 cm-1附近的拉曼譜帶歸屬為色氨酸側(cè)鏈，圖2 所示為不同微波處理下色氨酸側(cè)鏈的變化。由圖可知，色氨酸的相對(duì)拉曼強(qiáng)度經(jīng)微波處理后有較為明顯的降低，Li-Chan 研究指出色氨酸相對(duì)拉曼強(qiáng)度的降低與微環(huán)境狀態(tài)有關(guān)，色氨酸相對(duì)拉曼強(qiáng)度降低時(shí)色氨酸更趨近于“暴露態(tài)”。但隨著微波功率的進(jìn)一步增大，色氨酸相對(duì)拉曼強(qiáng)度呈現(xiàn)增大的變化趨勢(shì)，而色氨酸的增大主要是由于微波引起的米糠蛋白聚集使內(nèi)部的疏水性殘基包埋引起的。

2.1.3 微波處理對(duì)米糠蛋白二硫鍵振動(dòng)模式影響的拉曼分析

圖2 微波處理對(duì)色氨酸側(cè)鏈環(huán)境的影響Fig.2 Effect of microwave treatment on tryptophan side chain environment

圖3 米糠分離蛋白拉曼譜帶在490～560 cm-1區(qū)域內(nèi)的高斯擬合Fig.3 The decomposition of the components of rice bran protein in the ranges of 490-560 cm-1

500～550 cm-1范圍內(nèi)是二硫鍵的特征譜帶。二硫鍵在不同振動(dòng)模式下所反應(yīng)出來的拉曼位移有所不同，如500～510 cm-1處為gauche-gauche-gauche(g-g-g)模式，515～525 cm-1為gauche-gauche-trans(g-g-t)模式，535～545 cm-1為trans-gauche-trans(tg-t)模式［11］。

圖4 微波處理對(duì)米糠蛋白的二硫鍵的影響Fig.4 Effects of microwave treatment on the conformation of the S-S bonds of rice bran protein

由此結(jié)合圖4 可知，t-g-t 模式為米糠蛋白最主要的二硫鍵振動(dòng)模式，微波處理后t-g-t 模式總體增多，而其他兩種二硫鍵振動(dòng)模式含量在微波處理后均有所降低。隨著微波處理功率的增大，t-g-t 模式和g-g-g 模式均呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢(shì)，而二硫鍵的g-g-t 振動(dòng)模式含量則呈現(xiàn)先減少后增加的變化趨勢(shì)。對(duì)于隨著微波處理功率的增大二硫鍵的變化規(guī)律現(xiàn)今研究尚不能全面解析，因?yàn)榘殡S著微波輸出功率增大，微波極化作用及蛋白質(zhì)聚集作用的混合作用更為明顯，而上述兩種作用對(duì)蛋白質(zhì)二硫鍵的振動(dòng)模式影響更無法衡量。但有研究指出，二硫鍵的構(gòu)型特征與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成(尤其是α-螺旋結(jié)構(gòu))有關(guān)，并呈現(xiàn)一定的相關(guān)性［12］?？梢钥闯觯S著微波功率的增強(qiáng)，二硫鍵g-g-t 構(gòu)型變化趨勢(shì)與α-螺旋結(jié)構(gòu)變化相符，而其他二硫鍵構(gòu)型也表現(xiàn)出與β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量相似的變化趨勢(shì)，也在一定印證了二硫鍵研究的正確性，為后續(xù)深入探討奠定基礎(chǔ)。

2.2 溶解性

蛋白質(zhì)的溶解性是蛋白質(zhì)最主要功能特性，溶解性的表達(dá)在很大程度上影響著其他功能性質(zhì)，另外，蛋白質(zhì)的溶解性也會(huì)較為顯著地影響蛋白質(zhì)的商用及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

圖5 微波處理對(duì)米糠蛋白溶解性的影響Fig.5 Effects of microwave treatment on solubility of rice bran protein

由圖5 可知，微波處理后米糠蛋白的溶解性有所增大，溶解性在微波功率為528 W 時(shí)有最大值63.5%。另外，由圖5 也可得知，米糠蛋白在高功率下溶解性有所降低。

2.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性

圖6 微波處理對(duì)米糠蛋白乳化性的影響Fig.6 Effects of microwave treatment on emulsion of rice bran protein

乳化性是指互不相溶的液體在機(jī)械攪拌后形成乳液的能力。乳化性是蛋白質(zhì)較為重要的表面性質(zhì)之一，這主要是由于蛋白分子鏈內(nèi)分布有較多的親水或疏水基團(tuán)，親水性及疏水性基團(tuán)的存在也決定了蛋白質(zhì)的表面活性特點(diǎn)［13，14］。米糠蛋白乳化性在食品加工過程中起到了重要的作用，因此，現(xiàn)今研究多圍繞此功能性質(zhì)展開。

由圖6 可知，微波處理后米糠蛋白乳化性得到較大幅度提高，微波處理功率為296 W 時(shí)米糠蛋白乳化性有最大值54.6 m2/g。而在高微波功率下，米糠蛋白乳化性呈小幅降低，相較于微波處理功率為296 W，微波處理功率800 W 時(shí)米糠蛋白的乳化性為45.12%。

圖7 微波處理對(duì)米糠蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of microwave treatment on emulsion stability of rice bran protein

如圖7 所示，微波處理有益于米糠蛋白乳化性的穩(wěn)定，主要表現(xiàn)為微波處理下米糠蛋白乳化穩(wěn)定性均有所增加，米糠蛋白分子柔性的增強(qiáng)及內(nèi)部疏水性基團(tuán)的暴露是上述現(xiàn)象的主要原因。

2.4 起泡性

為了測(cè)試米糠蛋白的起泡性，試驗(yàn)采用泡沫膨脹率為指標(biāo)進(jìn)行分析。微波處理對(duì)米糠蛋白起泡性的影響如圖8 所示，由圖可知未處理?xiàng)l件下米糠蛋白的起泡性較差，這主要是由于米糠蛋白的結(jié)構(gòu)相對(duì)致密，內(nèi)部富含二硫鍵增進(jìn)了結(jié)構(gòu)的緊實(shí)性，難以分散形成泡沫［9］。

圖8 微波處理對(duì)米糠蛋白起泡性的影響Fig.8 Effects of microwave treatment on foamation of rice bran protein

由圖8 可知，微波處理后米糠蛋白的起泡性增大，微波處理功率為528 W 時(shí)米糠蛋白起泡性有最大值63.5%。而由于微波處理強(qiáng)度的進(jìn)一步增大，使米糠蛋白在高功率下起泡性降低。

圖9 微波處理對(duì)米糠蛋白起泡穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effects of microwave treatment on foamation stability of rice bran protein

由圖9 可知，微波處理后米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性并未發(fā)生顯著變化，這可能是由于微波處理下米糠蛋白的結(jié)構(gòu)重排主要影響了其起泡性，對(duì)于泡沫的形成穩(wěn)定性影響較不明顯。

3 討論與結(jié)論

微波處理總體降低了米糠蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)含量，但增加了β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量現(xiàn)有研究表明，蛋白質(zhì)的分子極化現(xiàn)象是微波處理的主要變化，微波處理下米糠蛋白的分子極化使維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)部分展開［9］、疏水性基團(tuán)的暴露，因而蛋白質(zhì)分子內(nèi)主要的有序結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序結(jié)構(gòu)。g-g-g 模式是典型的分子內(nèi)二硫鍵振動(dòng)模式，其含量的減少可以說明微波處理誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)的極化現(xiàn)象，蛋白質(zhì)在此過程中結(jié)構(gòu)展開，更多的分子內(nèi)二硫鍵通過巰基-二硫鍵交換反應(yīng)形成分子間二硫鍵。

上述蛋白質(zhì)在微波處理下的結(jié)構(gòu)變化，有利于水分子的浸入，進(jìn)而增強(qiáng)了水合作用，提高了米糠蛋白的溶解性［15］。且由于微波處理后米糠蛋白的分子結(jié)構(gòu)變得更為松散，內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，促進(jìn)了其與油脂之間的結(jié)合，而極性基團(tuán)與水之間亦發(fā)生明顯的水合作用，綜合效應(yīng)使米糠蛋白乳化性得以增強(qiáng)。微波場(chǎng)誘導(dǎo)下米糠蛋白分子結(jié)構(gòu)的展開也在一定程度上促進(jìn)了水-空氣界面的形成，另外，展開的蛋白質(zhì)分子間彼此作用構(gòu)成更加穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及界面膜，使米糠蛋白的起泡性得以增強(qiáng)［16，17］。

隨著微波強(qiáng)度的增大，米糠蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量先降低后增加，而β-折疊結(jié)構(gòu)含量總體呈降低趨勢(shì)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量先增加后降低。這種現(xiàn)象主要是由于蛋白分子結(jié)構(gòu)更大程度地展開，極化的蛋白分子之間相互吸引，通過疏水相互作用、二硫鍵、靜電相互作用及氫鍵等重新形成分子聚集體［12］。而蛋白質(zhì)的聚集現(xiàn)象考慮可能是米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在高功率微波處理下特殊變化的原因。另有部分研究表明，微波所引起的蛋白質(zhì)聚集是β-折疊構(gòu)象減少的一個(gè)重要原因［13］。對(duì)于無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在高功率微波處理下的降低，也能很好地證明米糠蛋白在此條件下發(fā)生了較為明顯的聚集現(xiàn)象。而在高功率下色氨酸趨于“包埋態(tài)”亦能說明米糠蛋白在此條件下發(fā)生了蛋白質(zhì)的聚集現(xiàn)象。

米糠蛋白在高微波處理?xiàng)l件下的溶解性降低與蛋白質(zhì)的變性及分子聚集有關(guān)，且由于蛋白質(zhì)分子之間的聚合使蛋白分子柔性降低，蛋白質(zhì)表面疏水性降低，進(jìn)而造成了米糠蛋白乳化性的降低。而米糠蛋白分子展開程度增大，內(nèi)部的疏水基團(tuán)和巰基暴露程度增加，極化的蛋白分子之間通過非共價(jià)鍵重新形成更大的分子聚集體，水-空氣界面膜的穩(wěn)定性下降［18-20］。

綜上所述，適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚砜梢愿纳泼卓返鞍椎娜芙庑?、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性等，拓寬米糠蛋白產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域。

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