火棘不可萃取多酚的提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究

許盈芃 ，劉 順，李楚楚，方天潤，邱 凡，陳西喆，鄢又玉*

1武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023;2 湖北神農(nóng)蜂語生物產(chǎn)業(yè)有限公司，十堰 442000

火棘(Pyracantha fortuneana)是薔薇科火棘屬植物，其果又名將軍糧、救軍糧、赤陽子、紅果等，廣泛分布于我國湖南、湖北、陜西及西南諸省。在傳統(tǒng)中醫(yī)中，火棘果常被用于治療消化不良［1］，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)火棘果提取物可抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的生成，在日本已作為增白劑用于化妝品中［2］，然而目前我國對(duì)火棘資源的開發(fā)不夠深入，每年大量的野生火棘資源被白白浪費(fèi)。

多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干酚性羥基的植物成分的總稱，包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等［3］。植物來源的多酚類化合物具有抗氧化［4］、抗 菌抗病毒［5］、抗腫瘤癌變［6］、抗肥胖［7］、降血糖［8］、降血脂［9］、抗心血管疾?。?0］等廣泛的生理活性和藥理活性?？偡?total polyphenol，TEPP)分為可萃取多酚(EPP)和不可萃取多酚(NEPP)兩部分［11］?？奢腿《喾又饕侵竿ㄟ^簡單的有機(jī)-水相溶劑萃取就可以獲得的處于游離狀態(tài)的多酚，而不可萃取多酚主要是指結(jié)合于細(xì)胞壁上的一些水合單寧酸和原花青素類，需通過化學(xué)或與細(xì)胞壁相關(guān)的酶處理，破壞多酚物質(zhì)與細(xì)胞壁結(jié)合的化學(xué)鍵，才能將其分離［12］。有研究表明，不可萃取原花青素可用硫酸從殘?jiān)兴舛茫?3］，不可萃取多酚的含量在多種植物資源中遠(yuǎn)高于可萃取多酚，在抗氧化方面的作用遠(yuǎn)大于可萃取多酚［14，15］，它們在食品、保健尤其是胃腸健康方面具有廣闊的應(yīng)用前景［16］。但目前國內(nèi)研究主要集中在幾種特色資源的可萃取多酚提取及功效研究方面，而不可萃取多酚的研究文獻(xiàn)甚少。

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)旨在優(yōu)化火棘不可萃取多酚的提取工藝，以提取可萃取多酚的火棘果殘?jiān)鼮樵?，采用Folin-ciocalteu法測定多酚含量［17］，輔 助ABTS法［18］和FRAP 法［19］對(duì)不可萃取多酚進(jìn)行快速抗氧化能力測定。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化得到NEPP 提取的最優(yōu)工藝。以期為未來火棘產(chǎn)業(yè)化深加工提供理論依據(jù)及開發(fā)方向。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

火棘果，2014年11月中旬采自湖北恩施來鳳地區(qū)，經(jīng)華中科技大學(xué)植物學(xué)博士楊悅鑒定為全緣火棘Pyracantha atalantioides的果實(shí);無水乙醇、濃H2SO4、無水Na2CO3均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;Folin-ciocalteu 試劑，Sigma 分裝，上海北諾生物科技有限公司;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110831-201403);總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP 法)、總抗氧化能力試劑盒(ABTS 法)，江蘇省碧云天生物技術(shù)研究所;Lambda 25 紫外-可見光分光光度計(jì)，美國PE 公司;DF-101B 集熱式磁力加熱攪拌器，金壇市醫(yī)療儀器廠;Centrifuge 5424R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司;Molelement1018a 型摩爾超純水機(jī)，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司;Anke LXJ-Π B 型低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;BS 系列電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;SB5200DTS雙頻超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取0.05 g 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中定容，分別取0.5 g/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、6、8、10、12、14 mL 加入到7個(gè)100 mL 容量瓶中，加水定容。各吸取1 mL 置于10 mL 試管中，分別加入Folin-ciocalteu 試劑5 mL，漩渦混勻后靜置3 min，再分別加入170 g/L Na2CO3溶液1.0 mL，混勻后置于34 ℃恒溫水浴中反應(yīng)40 min;同時(shí)做空白對(duì)照，于765 nm 波長處測定吸光度。

1.2.2 火棘EPP 的去除及NEPP 的提取

稱取一定量干燥粉碎過20 目篩的火棘果粉，按料液比1∶10 g/mL 加入90%(V/V)乙醇，90 ℃下回流提取1 h，過濾，濾渣重復(fù)提取2 次，合并3 次濾液，4 ℃條件下10000 rpm 離心20 min 以待后續(xù)EPP 含量測定(因3 次提取后濾液中EPP 含量甚微，可忽略，故前3 次提取合并濾液中EPP 可近似看做原料中總的EPP)。提取后的濾渣置80 ℃烘箱干燥，粉碎，過20 目篩。

去除EPP 的火棘果粉→加入乙醇-硫酸提取溶劑→水浴回流提取→冷水冷卻→10000 rpm 離心15 min→上清液中NEPP 含量的測定。

1.2.3 不可萃取多酚得率的測定

采用Folin-Ciocalteu 法測定NEPP 含量:將5 g去EPP 火棘干粉處理得到的各NEPP 提取液統(tǒng)一稀釋至180 mL，然后取1 mL 再次稀釋80 倍備用，參照1.2.1 同法操作測定NEPP 溶液吸光度，并帶入2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系式中進(jìn)行相關(guān)換算，火棘提取物中NEPP 含量(%)表示為去EPP 火棘干粉中以沒食子酸當(dāng)量的NEPP 的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

其中y 為NEPP 樣品溶液的吸光度。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取5.0 g 原料，以乙醇-硫酸為提取溶劑。考察不同乙醇濃度(100%、95%、90%、85%、80%)，乙醇-硫酸中乙醇所占比例(100%、95%、90%、85%、80%)，料液比(1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL)，提取時(shí)間(1、3、5、7、9 h)，水浴溫度(30、45、60、75、90 ℃)對(duì)NEPP 提取率的影響，結(jié)果參見圖1。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定乙醇-硫酸中乙醇所占比例為95%及料液比1∶20 g/mL，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)，以乙醇濃度(X1)、提取時(shí)間(X2)、提取溫度(X3)為主要考察因素，以NEPP 得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如下表1。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平及編碼值Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.6 抗氧化(ABTS 法及FRAP 法)檢測方法的建立

以實(shí)驗(yàn)制備的不同濃度的NEPP 溶液為待檢樣品，分別以Trolox 和FeSO4·7H2O 為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體操作參見碧云天生物技術(shù)研究所提供的總抗氧化能力測定試劑盒(ABTS 快速法及FRAP 法)說明書。取10 mmol/L Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 和1.5 mmol/L。在96 孔板每個(gè)檢測孔中加入20 μL 過氧化物酶工作液。以蒸餾水為空白對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔內(nèi)加入10 μL 各濃度Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品檢測孔內(nèi)加入10 μL 各種樣品，分別混勻。每個(gè)孔內(nèi)加入170 μL ABTS 工作液，混勻，室溫孵育6 min 后在415 nm 進(jìn)行測定。另外稱取27.8 mg FeSO4·7H2O，溶解并用蒸餾水稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 和1.5 mmol/L 。96 孔板的每個(gè)檢測孔中加入180 μL FRAP 工作液。蒸餾水為空白對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔內(nèi)加入5 μL 各種濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品檢測孔內(nèi)加入5 μL 各種樣品，混勻，37 ℃孵育3～5 min 后在595 nm 進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參照1.2.1 設(shè)計(jì)測定結(jié)果，以沒食子酸濃度(X，μg/mL)對(duì)吸光度(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.010X +0.048(R2=0.9996)，吸光度在質(zhì)量濃度為10～80 μg/mL 間線性關(guān)系良好。

2.2 火棘不可萃取多酚提取單因素試驗(yàn)

圖1 乙醇濃度(A)、乙醇-硫酸中乙醇所占比率(B)、液料比(C)、提取時(shí)間(D)及提取溫度(E)對(duì)火棘不可萃取多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration (A)，proportion of ethanol in ethanol-sulfuric acid (B)，liquid to solid ratio (C)，extraction time (D)and temperature (E)on NEPP yield of P.fortuneana

由圖1(A)可知，提高乙醇濃度有利于NEPP 的提取，當(dāng)乙醇濃度≥95%后，提取量上升趨勢漸緩，另外，出于成本經(jīng)濟(jì)考慮，故選擇乙醇濃度95%。由圖1(B)可知，乙醇-硫酸中乙醇所占比例≥95%之后，NEPP 提取率開始下降，乙醇濃度低于90%后NEPP 得率急劇下降，故乙醇-硫酸中乙醇所占比例選為95%比較合適。由圖1 (C)可知，料液比在1∶20 g/mL 時(shí)NEPP 的提取率達(dá)到極值，繼續(xù)增大料液比，NEPP 得率略有下降，考慮到不增加后續(xù)濃縮工序負(fù)擔(dān)，料液比選為1∶20 g/mL 比較合適。由圖1(D)可知，隨著提取時(shí)間的增加，NEPP 提取率先升后降，提取時(shí)間為3 h 時(shí)，提取率達(dá)到極值，進(jìn)一步增加提取時(shí)間，NEPP 提取率反而下降，這可能與高溫強(qiáng)酸條件下，提取出的NEPP 被降解破壞有關(guān)，故選擇提取時(shí)間為3 h。由圖1(E)可知，總體上隨著溫度的升高NEPP 提取率增大，提取溫度90 ℃時(shí)，提取率最高，溫度高于90 ℃之后，提取率反而略有下降，這可能與NEPP 的高溫降解有關(guān)。故選擇提取溫度90 ℃左右比較合適。

2.3 火棘不可萃取多酚提取響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

參照1.2.5 設(shè)計(jì)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design and the results

以NEPP 得率為主要響應(yīng)值，將表2 中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程:Y=4.40-0.25X1+0.37X2-并對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis for each item of regression equation

注:* P ＜0.05 顯著作用;＊＊P ＜0.01 高度顯著作用;＊＊＊P ＜0.001 極顯著作用。Note:* P ＜0.05 significant effect;＊＊P ＜0.01 very significant effect;＊＊＊P ＜0.001 extremely significant effect.

由表3 可知，除了X2X3項(xiàng)表明乙醇濃度和溫度的交互作用不顯著、X1X3項(xiàng)表明時(shí)間和溫度的交互作用顯著外，其他項(xiàng)均為極顯著。實(shí)驗(yàn)選用的模型(P＜0.001)極顯著，失擬項(xiàng)(P＞0.05)不顯著，表明該響應(yīng)面模型用于優(yōu)化NEPP 工藝是可行的。信噪比Adeq Precisior=25.386 比較高，說明該模型可以用于預(yù)測，而模型校正判定系數(shù)，說明該模型能解釋97.89%的響應(yīng)值變化。判定系數(shù)R2=0.990 8，說明模型擬合程度良好，可以使用該模型分析和預(yù)測火棘NEPP 的提取率0 與R2=0.990 8 的值相差不大說明該響應(yīng)面方程無需做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.2 NEPP 提取工藝響應(yīng)面圖分析與對(duì)比

根據(jù)2.3.1 所得回歸方程，考察擬合響應(yīng)面的形狀，繪制響應(yīng)面立體分析圖及相應(yīng)的等高線圖，結(jié)果見圖2。各影響因素及交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可通過圖2 中響應(yīng)面圖曲面陡峭程度和等高線圖中等高線密集程度直觀地反映出來。由圖2(A)可知，乙醇濃度效應(yīng)面相對(duì)更陡，等高線相對(duì)更密集。因此乙醇濃度的影響更為顯著，隨著乙醇濃度增加，NEPP 得率先增后減;提取時(shí)間的影響次之;由圖2(B)可知，提取時(shí)間效應(yīng)面相對(duì)更陡，等高線相對(duì)更密集。因此提取時(shí)間的影響更為顯著，隨著提取時(shí)間增加，NEPP 得率先增后減;提取溫度的影響次之;由圖2(C)可知，乙醇濃度效應(yīng)面相對(duì)更陡，等高線相對(duì)更密集。因此乙醇濃度的影響更為顯著，隨著乙醇濃度增加，NEPP 提取率先增后減;提取時(shí)間的影響次之;NEPP 提取率隨乙醇濃度的增大而增大;提取溫度的影響對(duì)比前2 個(gè)因素相對(duì)較弱但仍十分顯著，NEPP 提取率隨提取溫度的升高先升后降。從圖6(a-c)可以看出，響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線在所選的范圍內(nèi)存在極值，響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線中的最小橢圓的中心點(diǎn)［20］。等高線均成橢圓形說明各因素的交互作用強(qiáng)，也即3 個(gè)因素取不同的編碼值對(duì)Y 的影響表現(xiàn)出不同的規(guī)律，對(duì)火棘NEPP 提取率的影響顯著［21］，這一結(jié)論也與表3 方差分析結(jié)果一致。

2.3.3 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證

在節(jié)約成本同時(shí)使NEPP 提取率盡可能高的前提下，通過響應(yīng)面模型及其軟件優(yōu)化得到的最佳工藝條件為:提取時(shí)間2.68 h，乙醇濃度94.44%，水浴溫度83.47 ℃，此時(shí)NEPP 提取率最大理論值為4.49989%。為檢驗(yàn)該模型的可靠性，按照上述最優(yōu)方案進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)際提取條件:提取時(shí)間2.7 h，乙醇濃度95%，水浴溫度83 ℃，對(duì)3 組結(jié)果取平均值，所得NEPP 提取率為4.4294%，實(shí)際值與預(yù)測值接近。可見此模型可靠，可用于優(yōu)化火棘不可萃取多酚提取工藝。

2.4 NEPP 抗氧化量效關(guān)系分析

參照1.2.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)測定相關(guān)結(jié)果后，以Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X，mmol/L)對(duì)吸光度(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=-0.000 4X+0.587 1(R2=0.9998)，吸光度在質(zhì)量濃度為100～1300 μg/mL 間線性關(guān)系良好。以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X，mmol/L)對(duì)吸光度(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.1006 X+0.002 4(R2=0.9994)。吸光度在質(zhì)量濃度為150～1500 μg/mL 間線性關(guān)系良好。

圖2 乙醇濃度和提取時(shí)間(A)、提取溫度和提取時(shí)間(B)及提取溫度和乙醇濃度(C)對(duì)火棘不可萃取多酚得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour plots showing the mutual effects of ethanol concentration and extraction time (A)，extraction temperature and extraction time (B)as well as extraction temperature and ethanol concentration (C)on the extraction yield of NEPP from P.fortuneana

本實(shí)驗(yàn)主要研究任務(wù)是對(duì)火棘中不可萃取多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化的同時(shí)兼測提取液總抗氧化能力的變化。由表2 中17 組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，我們分別測得NEPP 溶液吸光度并推算出其相應(yīng)質(zhì)量濃度，ABTS 及FARP 總抗氧化吸光度響應(yīng)值，以NEPP濃度(x，mg/mL)分別對(duì)ABTS 及FARP 響應(yīng)值(y)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果參見圖3，分別得回歸方程y1=5.10196x+0.44512(R2=0.8907)，y2=2.31721x +0.24157(R2=0.8505)。分析可知NEPP 濃度與ABTS 及FRAP 總抗氧化能力呈現(xiàn)正相關(guān)，相關(guān)性良好。

2.5 火棘EPP 及NEPP 含量的測定

按1.2.2 設(shè)計(jì)提取火棘EPP，重復(fù)3 組，每組重復(fù)提取3 次合并，按Folin-Ciocalteu 法測定吸光度，并帶入2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出提取液中EPP質(zhì)量濃度(μg/mL)，根據(jù)提取液體積及提取物料質(zhì)量，3 次結(jié)果取平均值，可得火棘中EPP 含量為40.4 mg/g;按2.3.3 響應(yīng)面最優(yōu)提取方案提取3 組，同法算出火棘中NEPP 含量167.328 mg/g，因?yàn)镹EPP提取時(shí)溶劑中加入強(qiáng)酸，一次提取時(shí)強(qiáng)酸對(duì)植物細(xì)胞壁的破壞就相當(dāng)徹底，因此一次提取的NEPP 量可近似看做火棘果皮肉粉中NEPP 總量。顯然，通過計(jì)算可知，NEPP 占TPP 總量的80.55%，占火棘總酚的絕大部分，從而進(jìn)一步證明優(yōu)化NEPP 的提取工藝相當(dāng)重要。

圖3 不可萃取多酚濃度與抗氧化能力相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of NEPP and its antioxidant capacity

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)確定提取工藝中最適乙醇濃度為95%，提取時(shí)間3 h，乙醇-硫酸中乙醇所占比例為95%，料液比為1∶20(質(zhì)量濃度，g/mL)，提取溫度95 ℃。進(jìn)一步應(yīng)用響應(yīng)面軟件建立優(yōu)化方案，模型顯著，最佳提取工藝條件為:提取時(shí)間2.68 h，乙醇濃度94.44%，溫度83.47 ℃。此時(shí)，NEPP 提取量可達(dá)167.328 mg/g，EPP 提取量僅為40.4 mg/g，NEPP占TEPP 含量的80.55%，約為EPP 含量的四倍。

同時(shí)對(duì)NEPP 與抗氧化能力進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明NEPP 濃度與ABTS 及FRAP 抗氧化能力之間均存在良好的正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性并非特別顯著，這可能是由于火棘中還含有其它具有抗氧化能力的成分，或是不同種類的不可萃取多酚的抗氧化能力不一而造成的，而且同一種多酚類物質(zhì)對(duì)超氧自由基和羥自由基的清除率也是不同的，這可能與它們的結(jié)構(gòu)有關(guān)［22］。因此未來我們應(yīng)該進(jìn)一步深入研究火棘總酚的分類、結(jié)構(gòu)及其與抗氧化功效或其他功效之間的關(guān)系，以期推動(dòng)火棘資源產(chǎn)業(yè)化。

1 Deng RF (鄧如福)，Wang SG (王三根)，Li GR (李關(guān)榮).Studies on the nutritional components of the fruit of the wild plant-firethorn.Acta Nutr Sin(營養(yǎng)學(xué)報(bào))，1990，1:79-84.

2 Van Gelder CWG，F(xiàn)lurkey WH，Wichers HJ.Sequence and structural features of plant and fungal tyrosinases.Phytochemistry，1997，45:1309-1323.

3 Yong JW，Zhong C，Jian WM，et al.Optimization of ultrasonic-assisted extraction process ofPoria cocospolysaccharides by response surface methodology.Carbohydr Polym，2009，77:713-717.

4 Pandey KB，Rizvi SI.Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease.Oxid Med Cell Longev，2009，2:270-278.

5 Jia Q，Liu X，Wu X，et al.Hypoglycemic activity of a polyphenolic oligomer-rich extract ofCinnamomum parthenoxylonbark in normal and streptozotocin-induced diabetic rats.Phytomedicine，2009，16:744-750.

6 Cai Y，Luo Q，Sun M，et al.Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer.Life Sci，2004，74:2157-2184.

7 Jadeja RN，Thounaojam MC，Ramani UV，et al.Anti-obesity potential ofClerodendron glandulosum.Coleb leaf aqueous extract.J Ethnopharmacol，2011，135:338-343.

8 Anderson RA，Broadhurst CL，Polansky MM，et al.Isolation and characterization of polyphenol type-A polymers from cinnamon with insulin-like biological activity.J Agric Food Chem，2004，52:65-70.

9 Saliu JA，Ademiluyi AO，Akinyemi AJ，et al.In vitroantidiabetes and antihypertension properties of phenolic extracts from bitter leaf (Vernonia amygdalinaDel.).J Food Biochem，2012，36:569-576.

10 Furuuchi R，Sakai H，Hirokawa N，et al.Antihypertensive effect of boysenberry seed polyphenols on spontaneously hypertensive rats and identification of orally absorbable proanthocyanidins with vasorelaxant activity.Biosci Biotechnol Biochem，2012，76:1694-1701.

11 Saura-Calixto F，Serrano J，Go?i I.Intake and bioaccessibility of total polyphenols in a whole diet.Food Chem，2007，101:492-501.

12 Arranz S，Saura-Calixto F，Shaha S，et al.High contents of nonextractable polyphenols in fruits suggest that polyphenol contents of plant foods have been underestimated.J Agric Food Chem，2009，57:7298-7303.

13 Matthews S，Mila I，Scalbert A，et al.Extractable and non-extractable proanthocyanidins in barks.Phytochemistry，1997，45:405-410.

14 Madhujith T，Shahidi F.Antioxidant potential of barley as affected by alkaline hydrolysis and release of insoluble-bound phenolics.Food Chem，2009，117:615-620.

15 Chandrasekara A，Shahidi F.Content of insoluble bound phenolics in millets and their contribution to antioxidant capacity.J Agric Food Chem，2010，58:6706-6714.

16 Pérez-Jiménez J，Díaz-Rubio ME，Saura-Calixto F.Non-extractable polyphenols，a major dietary antioxidant:occurrence，metabolic fate and health effects.Nutr Res，2013，26:118-129.

17 Slinkard K，Singleton VL.Total phenol analysis:automation and comparison with manual methods.Am J Enol Viticult，1977，28:49-55.

18 Lu G (盧弓)，Li GY(李光勇)，Wei JF(魏金鳳)，et al.Establishment of micro-model for scavenging ABTS Free Radical.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，25:1533-1535.

19 Benzie IFF，Strain JJ.The ferric reducing ability of plasma(FRAP)as a measure of“antioxidant power”:the FRAP assay.Anal Biochem，1996，1:70-76.

20 Huang Q(黃群)，Yang WG(楊萬根)，Yu J(余佶)，et al.Process optimization for antioxidant peptide preparation fromEucommiaseed meal protein by enzymatic hydrolysis.Food Sci(食品科學(xué))，2013，34:205-209.

21 Xu X，Gao Y，Liu G，et al.Optimization of supercritical carbon dioxide extraction of sea buckthorn (Hippophae thamnoidesL.)oil using response surface methodology.LWTFood Sci Technol，2008，41:1223-1231.

22 Li W(李偉)，Zhang YT (張應(yīng)團(tuán)).The antioxidation effect ofPyracantha fortuneanapolyphenolin vitro.Sci Tech Food Ind(食品工業(yè)科技)，2008，29:121-123.