響應(yīng)面法優(yōu)化黃參多糖的提取工藝及其體外抗氧化活性

徐運飛 ，劉 琴，宋 珅，魏燕霞，王風(fēng)霞，高清雅，趙 敏，張 繼*

1西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2 甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心;3西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，蘭州 730070

黃參是傘形科(Umbelliferae)屬的單種植物迷果芹(Sphallerocarpus gracilis)的肉質(zhì)根，呈淡黃色，外形酷似人參，故又名黃參。據(jù)經(jīng)典本草著作《晶珠本草》記載:迷果芹澀、溫、治黃水病，腎病、腰痛、腫痛，腎腰寒氣病(藏藥志)迷果芹全草均可入藥，可祛風(fēng)濕，可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［1-4］。邸多?。?］等用60%～70%的黃參多糖提取物、0.1%～0.5%的阿斯巴甜、0.3%～1.0% 的L-薄荷腦、27%～37%的D-甘露糖醇、0.3%～1.0%的微粉硅膠及0.4%～1.5%的硬脂酸鎂制備了一種黃參多糖含片，該含片口感好，具有增強免疫力、降血壓、血糖和血脂的作用。

常規(guī)熱水法是實驗室提取多糖最常用的方法之一，具有操作簡單、設(shè)備要求低、對環(huán)境友好等優(yōu)點，最重要的是與其它方法相比，對天然活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響小，因此被廣泛應(yīng)用于包括多糖的水溶性活性成分的提取研究。

許多研究都表明［6］，氧化與人類的許多疾病諸如癌癥、動脈硬化等的發(fā)病機理有關(guān)，例如自由基引發(fā)的氧化現(xiàn)象是機體衰老的主要原因。適當(dāng)攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以抑制所產(chǎn)生的自由基對機體造成的損傷，切斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，幫助機體抵御和防治相關(guān)疾病，延緩衰老維持機體健康［7］。目前對于黃參多糖的研究較少，對其活性的研究未見報道。本實驗對黃參多糖的抗氧化活性做了研究，以期為黃參的高值化開發(fā)利用和黃參多糖研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

黃參(甘肅省，山丹縣)，經(jīng)西北師范大學(xué)張繼教授鑒定為傘形科迷果芹屬。60 ℃下干燥48 h，粉碎，過100 目篩，備用。

氯仿(分析純)，忠義化工;NaOH(分析純)，天津凱信化工有限公司;無水乙醇，天津精細化工廠;HCl(分析純)，西安化學(xué)試劑廠，纖維素酶(2 萬U/g)，北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司;木瓜蛋白酶(65萬U/g)，上海信裕生物科技有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，四唑氮藍(NBT)，還原型輔酶Ⅰ(NADH)，吩嗪硫酸甲酯(PMS)，水楊酸，三氯乙酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，抗壞血酸(Vc)，K2HPO4，KH2PO4，鐵氰化鉀，均為分析純。

1.2 儀器

BL320H 型電子天平，日本島津;JRA-6 型數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司;FSH-2A 型可調(diào)高速分散器，常州華冠儀器制造有限公司;KQ-400GKDV 型實驗用超聲儀(恒定功率250W)，常州諾基儀器有限公司;TDL5M 型臺式大容量冷凍離心機，湘儀離心機廠;LGJ-185 型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司;SB-35型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA;UV1000 紫外可見分光光度計，Labtech;SHB-Ⅲ型多用循環(huán)真空泵等。

2 實驗方法

2.1 常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖

黃參在60 ℃下干燥48 h，粉碎，過100 目篩，備用。取一定量粉碎過篩后的黃參粉末，以蒸餾水為溶劑，以一定的料液比、提取時間和提取溫度條件下常規(guī)熱水提取黃參多糖。提取液經(jīng)4000 rpm 離心10 min，取上清60 ℃減壓濃縮，加入無水乙醇至終濃度為80%，醇沉24 h，5000 rpm 離心10 min，取下層沉淀，-60 ℃冷凍干燥得到黃參粗多糖。黃參粗多糖經(jīng)木瓜蛋白酶和Sevage 偶聯(lián)法脫去蛋白，60 ℃減壓濃縮，加入無水乙醇醇沉24 h，5000 rpm 離心10 min，取下層沉淀，-60 ℃冷凍干燥得到黃參多糖。

2.2 多糖得率的計算［8，9］

將冷凍干燥后未經(jīng)脫蛋白的粗多糖在電子天平上進行稱重得到黃參多糖的質(zhì)量，用以下公式進行計算黃參粗多糖的得率:

2.3 常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖的單因素實驗

影響熱水提取黃參多糖得率的主要因素有料液比、提取時間、提取溫度和提取次數(shù)等。本實驗中提取次數(shù)分別選取1 次、2 次、3 次、4 次和5 次五個水平，其他參數(shù)為:料液比1∶30(g/mL)，提取時間5 h，提取溫度80 ℃;料液比(原料∶水)選取1 ∶10、1∶20、1∶30、1∶40 和1∶50(g/mL)五個水平，其他參數(shù)為:提取時間5 h，提取溫度80 ℃;提取時間選取1、3、5、7 h 和9 h 五個水平，其他參數(shù)為:料液比1∶30(g/mL)，提取溫度80 ℃;提取溫度選取40、50、60、70、80 ℃和90 ℃六個水平，其他參數(shù)為:料液比1∶30(g/mL)，提取時間5 h。

2.4 熱水法提取黃參多糖的響應(yīng)面實驗設(shè)計

在熱水法提取黃參多糖單因素實驗基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面試驗，確定了提取時間、提取溫度及液料比的最佳工藝參數(shù)，以多糖得率為指標(biāo)，因素水平見表1。

表1 實驗因素、水平及編碼Table 1 Experiment factors，levels and code

2.5 黃參多糖的體外抗氧化活性評價

2.5.1 黃參多糖對DPPH 自由基的清除作用

準(zhǔn)確稱取一定量的VC和黃參多糖，充分溶解后配制濃度為5.0 mg/mL 的母液，再稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02 mg/mL，取1 mL不同質(zhì)量濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液、2 mL DPPH 溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)、2 mL 甲醇溶液充分混合均勻后在黑暗中靜置30 min，在517 nm 處測定吸光值［10］。以VC作為陽性對照。每個樣品重復(fù)三次，求平均值。DPPH 自由基清除率公式如下:

式中:A0表示無樣品的DPPH 溶液的吸光值;Ai表示待測樣與DPPH 混合溶液的吸光值;Aj表示不加DPPH 的樣品的吸光值。

2.5.2 黃參多糖對·OH 自由基的清除作用

準(zhǔn)確稱取一定量的VC和黃參多糖，充分溶解后配制濃度為5.0 mg/mL 的母液，再稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02 mg/mL，將2 mL多糖溶液、2 mL 6 mmol/L 的FeSO4溶液、H2O2溶液混勻后靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L 的水楊酸溶液，混勻，靜置30 min 后，在510 nm 處測定吸光值［11］。以VC作為陽性對照組。每個樣品重復(fù)三次，求平均值?！H 清除率計算公式如下:

式中:A0表示無樣品的混合反應(yīng)液的吸光值;Ai表示待測樣與混合反應(yīng)液的吸光值;Aj表示不加水楊酸的樣品溶液的吸光值。

PMS/ NADH 體系會產(chǎn)生超氧陰離子自由基，用NBT 顯色法測定。準(zhǔn)確稱取一定量的VC和黃參多糖，充分溶解后配制濃度為5.0 mg/mL 的母液，再稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02 mg/mL，反應(yīng)混合物中依次加入不同濃度的多糖溶液，Tris-HCl (16 mmol/L，pH 8.0)，NADH (557 μmol/L)，NBT(108 μmol/L)和PMS(45 μmol/L)，在25 ℃溫浴5 min，在560 nm 下測吸光值［12］。以VC作為陽性對照組。每個樣品重復(fù)三次，求平均值。清除率公式如下:

式中:A0表示無樣品的混合反應(yīng)液的吸光值;Ai表示待測樣與混合反應(yīng)液的吸光值。

2.5.4 還原力的測定

準(zhǔn)確稱取一定量的黃參多糖和VC，充分溶解后配制濃度為5.0 mg/mL 的母液，再稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02 mg/mL。不同濃度的多糖溶液(0.02～2 mg/mL)1 mL、2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH=6.6)、鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］溶液(1%)2.5 mL 混合均勻，50 ℃水浴20 min。加入10%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。在700 nm 下測吸光值［13］。以VC作為陽性對照，吸光值越高還原力越強。

3 結(jié)果與討論

3.1 常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖

3.1.1 單因素結(jié)果與分析

3.1.1.1 提取次數(shù)對黃參多糖得率的影響

由圖1a 得知，隨著提取次數(shù)的增加，黃參多糖的得率呈現(xiàn)迅速增加的趨勢，在提取次數(shù)達到3 次以上時，隨著提取次數(shù)的增加多糖得率增幅緩慢，為了節(jié)約資源，簡化操作，確定次數(shù)為3 次。

3.1.1.2 提取時間對黃參多糖得率的影響

由圖1(b)得知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，黃參多糖的得率先增大后減小，在提取時間為5 h 時，多糖得率最高。這是因為處理時間太短，原料中的多糖溶解不充分;而時間過長，會使多糖降解為單糖、寡糖或低聚糖，導(dǎo)致得率的下降［8］。因此，提取時間應(yīng)確定為5 h。

3.1.1.3 提取溫度對黃參多糖得率的影響

由圖1(c)可知，提取溫度對黃參多糖得率的影響顯著，隨著提取溫度的升高，多糖得率顯著提高，在70 ℃時最高，溫度過高時，溶液中的多糖會有損失，所以溫度在達到一定水平后，多糖得率逐漸降低，而且溫度過高可能會造成多糖活性的喪失。因此，確定提取溫度為70 ℃。

3.1.1.4 料液比對黃參多糖的率的影響

由圖1(d)可知，料液比對多糖得率的影響較為顯著，隨著料液比的增大多糖的得率逐漸增加，在料液比為1∶30(g/mL)時得率最高，隨后隨著料液比的增大多糖得率逐漸降低。這可能是因為料液比小，提取體系中含水量少，原料中的多糖不能充分溶出，料液比太大，濃縮時間延長，導(dǎo)致多糖損失［14］，得率降低。因此，因選擇料液比為1∶30(g/mL)。

3.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化熱水提取黃參多糖的工藝研究

圖1 提取次數(shù)(a)、提取時間(b)、溫度(c)及料液比(d)對多糖得率的影響Fig.1 The effect of times of extraction (a)，extraction duration(b)，extraction temperature(c)and solid/liquid ratio (d)on the yield of polysaccharide

以黃參多糖得率為響應(yīng)值Y，通過SAS 軟件對試驗資料進行響應(yīng)面分析，共17 個試驗點，其中12個為析因點，5 個為零點，析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點;零點為區(qū)域的中心點，其中零點試驗重復(fù)5 次，用以估算試驗誤差［15］。試驗結(jié)果見表4，經(jīng)二次回歸擬合后求得響應(yīng)函數(shù)，得到的回歸方程如下:

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 RSM design matrix and the responses

表3 多糖得率回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Regression coefficient and ANOVA test of the yield of polysaccharide

方差分析見表3。模型誤差顯著，失擬誤差不顯著，回歸系數(shù)R2為0.991，說明模型的擬合度很好，響應(yīng)值的99.1%的是由于所選變量引起的，決定系數(shù)(R2adj=0.9795)接近于1，變異系數(shù)(C.V.=3.87%)很低，都說明模型相關(guān)性高，用該模型模擬真實的三因素三水平的分析是可行的［16］。可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同提取條件下黃參多糖的得率的變化。

由表3 的結(jié)果可以看出三個因素對多糖得率影響的主次是X2＞X1＞X3，一次項XI、X2、X3，二次項和交互項XIX2、XIX3都是極顯著的，表明各因素不是簡單的線性關(guān)系，且對響應(yīng)值的影響有明顯的交互作用。

從響應(yīng)面分析圖2(a)、(b)和(c)中可以看出響應(yīng)值與影響因素的關(guān)系:提取溫度對黃參多糖提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，其次依次為提取時間和料液比，表現(xiàn)為曲線較平緩。

3.1.3 優(yōu)化提取參數(shù)

根據(jù)所得模型由SAS 軟件分析得到黃參多糖熱水提取的最佳條件為:提取時間為5.44 h，溫度為74.79 ℃，料液比為1∶34.19(g/mL)，理論最佳提取率為12.61%。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳提取條件進行黃參多糖熱水提取的驗證實驗，同時考慮到實際操作和生產(chǎn)的便利，因此將熱水提取黃參多糖的各個實驗因素條件修訂為:時間5.45 h，溫度為75 ℃，料液比為1∶34(g/mL)。經(jīng)過5 次平行實驗，得到的平均得率為12.52%。提取率與預(yù)測結(jié)果契合度高，說明該工藝穩(wěn)定可行，適合黃參多糖的提取。

3.2 黃參多糖的體外抗氧化活性

3.2.1 黃參多糖對DPPH·自由基的清除作用

DPPH·自由基被認為一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物可以清除它，則表明受試物具有抗氧化活性。DPPH·有個單電子，在517 nm 有最大吸收，其甲醇溶液呈深紫色，加入有抗氧化活性的受試物后能與DPPH·的單電子配對，從而使得DPPH·的濃度減小顏色變淺，光吸收值減?。?7］。黃參多糖對DPPH·自由基的清除作用見圖3(a)。結(jié)果顯示，在實驗濃度范圍內(nèi)，黃參多糖對DPPH·自由基有一定的清除作用，隨著濃度的升高，清除作用也逐漸加強，當(dāng)黃參多糖濃度為2 mg/mL 時，對DPPH·自由基的清除率可達到63%。

圖2 提取時間和料液比(a)、料液比和提取溫度(b)及提取溫度和提取時間(c)對黃參多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour plots showing the effects of extraction duration and solid/liquid ratio (a)，solid/liquid ratio and extraction temperature (b)and extraction duration and extraction temperature (c)on extraction yield of S.gracilis polysaccharide

3.2.2 黃參多糖對·OH 自由基的清除作用

·OH 是一種活性氧自由基，毒性極強，可造成生物膜損傷，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，物理輻射等因素都會促進其形成［18］。黃參多糖對·OH 自由基的清除作用與黃參多糖的濃度成正相關(guān)，見圖3(b)，當(dāng)黃參多糖濃度為2 mg/mL 時，對·OH 自由基的清除率可達72.3%。

3.2.3 黃參多糖對超氧自由基的清除作用

超氧陰離子自由基是人體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，加快肌體的衰老，誘發(fā)癌癥、心血管疾病，嚴(yán)重危害人體健康［19］。實驗結(jié)果表明黃參多糖對超氧自由基有一定的清除作用，如圖3(c)所示，隨著黃參多糖濃度的增加，清除作用逐漸增強，多糖濃度為5 mg/mL 時對超氧陰離子自由基的清除為78.2%。

3.2.4 還原力

圖3 黃參多糖與Vc 對DPPH·自由基(a)、·OH 自由基(b)及超氧自由基(c)的清除能力及還原力(d)比較Fig.3 Comparison of DPPH radical scavenging ability (a)，hydroxyl radical scavenging ability (b)，super radical scavenging ability(c)and reducing power (d)of S.gracilis polysaccharide and Vc

抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基，還原力越強，抗氧化性越強［20］。因此，可通過測定還原力來說明其抗氧化活性的大小。從圖3(d)可以看出，與VC相比，黃參多糖的還原力很弱，隨著黃參多糖濃度的增加，其總還原力呈緩慢增大，總體上呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

4 討論與結(jié)論

多糖又稱多聚糖，是機體內(nèi)一類重要的生物活性物質(zhì)，由一種或多種單糖通過糖苷鍵連接而成，廣泛存在于動物、植物、真菌等有機體中，與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸一起被視為生物體中最重要的4 種生物大分子物質(zhì)［21］?，F(xiàn)代研究證明多糖有多種生物活性和功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗凝血、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等。丁春邦等用熱水法、微波法和酶法從淫羊藿中提取多糖并對幾種方法得到的多糖的抗氧化活性做了評價，結(jié)果表明熱水法得到的多糖抗氧化活性最高。陳群和劉家昌［22］在對人參多糖、黃芪多糖和枸杞多糖的研究中發(fā)現(xiàn)，人參多糖、黃芪多糖和枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗衰老作用;人參多糖、黃芪多糖還具有抗腫瘤作用［23］。

本文利用常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖，通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化得到了其提取工藝的最佳工藝參數(shù);常規(guī)熱水提取法提取黃參多糖的提取方法提取工藝條件為:時間5.45 h，溫度為75 ℃，料液比為1∶34(g/mL)，多糖得率為12.52%。該方法省時、環(huán)保，多糖得率高，適合黃參多糖的提取。與其它提取工藝相比，該方法的特點是簡單有效，在一般實驗室條件下都能夠?qū)崿F(xiàn)，能夠被廣泛應(yīng)用，而且提取多糖的得率較高。并且，通過考察黃參多糖對和自由基的清除能力以及對亞鐵離子螯合作用和還原力的作用，結(jié)果表明，黃參多糖具有良好的抗氧化活性，為對其深入研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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