芪參安胃口服液中黃芪甲苷含量測定的研究

王海燕 ，柳慶坤，劉廣文(泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 泰安 271000)

芪參安胃口服液是由黃芪、苦參等7 味藥材經(jīng)提取、濃縮、加工而制成的液體制劑，具有補(bǔ)氣健脾、消積和胃的功效［1］。黃芪為方中要藥，其所含的成分主要為黃芪甲苷等皂苷類成分及毛蕊異黃酮等黃酮類成分［2］。黃芪甲苷含量高、性質(zhì)穩(wěn)定，故以黃芪甲苷作為黃芪藥材含量測定成分的報(bào)道居多［3-5］。芪參安胃口服液方中有山楂等含有大量黃酮類成分，導(dǎo)致毛蕊異黃酮干擾嚴(yán)重，雜質(zhì)較多，且毛蕊異黃酮對(duì)照品較難得到，故試驗(yàn)用高效液相法測定樣品中的黃芪甲苷含量。黃芪甲苷的測定方法較成熟，2010 年版《中華人民共和國藥典:一部》(以下簡稱《中國藥典:一部》)“黃芪藥材含量測定”項(xiàng)下采用高效液相法對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行了測定［1］。為更好地控制本品質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法對(duì)芪參安胃口服液中黃芪甲苷的含量進(jìn)行測定。

周大娘也一定知道金枝賺到錢了，因?yàn)槊總€(gè)新來的第一次“賺錢”都是過分的羞恨。羞恨摧毀她，忽然患著傳染病一般。

1 材料

1.1 儀器

METTLER TOLEDO AL204 型電子天平(梅特勒-托利多上海公司);KQ-500B 型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);高效液相色譜儀(LC-20 AB 泵、SIL-20A 型自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司);Alltech Grace ELSD 3300 型檢測器(上海埃文斯科貿(mào)有限公司)。

1.2 藥品與試劑

乙腈為色譜純(美國Sigma 公司);水為超純水(Millipore超純水系統(tǒng));其他試劑均為分析純。黃芪甲苷對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號(hào):110781-200903)，供含量測定用，純度均為100%。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定條件的考察

2.1.1 檢測器的選擇:對(duì)黃芪甲苷對(duì)照品溶液作光譜圖測定，結(jié)果顯示，在204 nm 處有最大吸收，末端吸收，用高效液相檢測器難度較大，故本品根據(jù)2010 年版《中國藥典:一部》“黃芪藥材含量測定”項(xiàng)下的方法及文獻(xiàn)報(bào)道，采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。

在改革之初，農(nóng)場先后開展了“深化改革、加快發(fā)展”解放思想大討論活動(dòng)和“解放思想促改革”主題教育活動(dòng)，制定了教育活動(dòng)時(shí)間表路線圖，并把主題教育活動(dòng)融入到改革具體工作中，把思想發(fā)動(dòng)貫穿于改革的全過程、各環(huán)節(jié)，做到重點(diǎn)突出、統(tǒng)籌兼顧，同步推進(jìn)。

2.2 供試品的制備

本品中含有大量的黏液質(zhì)、多糖等干擾成分，若直接注入液相測定，則雜質(zhì)峰多且對(duì)色譜柱損害大，因此，需經(jīng)純化后注入液相色譜儀測定。同時(shí)，根據(jù)2010 年版《中國藥典:一部》測定黃芪甲苷含量的方法，折算應(yīng)取藥液15 ml 為宜，具體制備方法考察如下。

按處方比例，不加黃芪藥材，按本品制備工藝制得缺黃芪的空白樣品，再按上述方法制備缺黃芪的空白對(duì)照溶液，使用高效液相色譜儀測定。結(jié)果顯示，在黃芪甲苷峰位處無吸收，空白無干擾。最終確定的供試品制備方法為:取本品，搖勻，精密量取15 ml，置離心管中，加乙醇75 ml，搖勻，靜置冷藏2 h，離心;殘?jiān)僖陨倭?0% 乙醇洗滌，離心，合并乙醇液，水浴蒸干，殘?jiān)铀?5 ml 使溶解;用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次20 ml，合并正丁醇液;用氨試液洗滌2 次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓⑥D(zhuǎn)移至5 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(1.503 6 mg/ml)，按“2.1”項(xiàng)下方法使用高效液相色譜儀測定，進(jìn)樣10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得 峰 面 積 分 別 為89 601、92 284、89 250、93 162、91 047、91 324，平均為91 111.33，RSD為1.66%。結(jié)果顯示，精密度良好。

2.3 空白試驗(yàn)

2.2.1 提取方法考察:(1)提取方法1:取本品，搖勻，精密量取15 ml，用水飽和正丁醇振搖提取4 次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至5 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得［6-8］。(2)提取方法2:取本品，搖勻，精密量取15 ml，置離心管中，加乙醇75 ml，搖勻，靜置冷藏2 h，離心，殘?jiān)僖陨倭?0%乙醇洗滌，離心，合并乙醇液，水浴蒸干，殘?jiān)铀?5 ml 使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4 次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至5 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。分別精密吸取上述2 種供試品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果顯示，提取方法1 的萃取易分層，易分離，峰面積為34 809;提取方法2的萃取易分層，易分離，峰面積為24 339。提取方法2 以乙醇沉淀除雜，易導(dǎo)致成分損失，而提取方法1 提取則較完全，故本品選擇提取方法1 的方法提取本品。

2.4 線性關(guān)系考察

隨著對(duì)中國社會(huì)的發(fā)展，學(xué)術(shù)界、社會(huì)政策界和全社會(huì)對(duì)兒童境況關(guān)注的程度增加，國家對(duì)兒童福利的投入增加，政策制定者和學(xué)術(shù)界都感到有必要整合不同的名詞，使用統(tǒng)一的政策術(shù)語，指代需要國家福利幫助的兒童，并以此代替上述各種不能準(zhǔn)確指代困境兒童的術(shù)語。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of standard curve test

2.5 精密度考察

2.2.2 供試品精制方法考察:(1)精制方法1:取本品，搖勻，精密量取15 ml，置離心管中，加乙醇75 ml，搖勻，靜置冷藏2 h，離心，殘?jiān)僖陨倭?0%乙醇洗滌，離心，合并乙醇液，水浴蒸干，殘?jiān)铀?5 ml 使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)铀? ml 使溶解，放冷，通過D101 型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm)，以水50 ml 洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 ml 洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 ml 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。(2)精制方法2:取本品(批號(hào):20100801)，搖勻，精密量取15 ml，置離心管中，加乙醇75 ml，搖勻，靜置冷藏2 h，離心，殘?jiān)僖陨倭?0%乙醇洗滌，離心，合并乙醇液，水浴蒸干，殘?jiān)铀?5 ml 使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至5 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。分別精密吸取上述兩種溶液各20 μl 注入液相色譜儀，測定，結(jié)果顯示，精制方法1 的黃芪甲苷峰面積為24 880;精制方法2 為34 352。精制方法2 的黃芪甲苷峰面積明顯高于制備方法1，故本品選擇制備方法2 的方法制備本品的供試品溶液。

2.1.2 檢測參數(shù):(1)高效液相色譜參數(shù):以Shimadzu LC-10A 高效液相色譜色譜儀檢測本品中黃芪甲苷的含量，考查不同的流動(dòng)相、不同的色譜柱對(duì)本品的影響。結(jié)果顯示，流動(dòng)相為乙腈-水(V∶V=32∶68)時(shí)，保留時(shí)間約10 min，基線較平;色譜柱為Shimadzu C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18柱(150 mm×4.6mm，5 μm)時(shí)，黃芪甲苷峰分離度均較好。因此，最終確定以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，采用Shimadzu 或Kromasil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，后續(xù)試驗(yàn)均用Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱;以乙腈-水(V∶V=32 ∶68)為流動(dòng)相。(2)蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù):采用ELSD 2000 型蒸發(fā)光散射檢測器，考查漂移管溫度、載氣流速對(duì)本品的影響。結(jié)果顯示，漂移管溫度為105 ℃時(shí)，基線較好，峰分離好;載氣流速為2.7 ml/min 時(shí)，峰狀態(tài)較好。由此，最終確定漂移管溫度為105 ℃，載氣流速為2.7 ml/min。

圖1 黃芪甲苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of Astragaloside A

2.6 中間精密度考察

取本品，搖勻，精密量取15 ml，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法，在同一實(shí)驗(yàn)室，考察不同操作者、不同時(shí)間、不同儀器的精密度，進(jìn)樣20 μl，各連續(xù)進(jìn)樣3 次，測得峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，中間精密度良好，見表2。

2.7 穩(wěn)定性考察

取對(duì)照品(黃芪甲苷含量為0.1240 mg/ml)，搖勻，精密量取7.5 ml，稱取6 份，分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品水溶液(0.1438 mg/ml)7.5 ml，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測定，計(jì)算回收率:回收率=(測得量-樣品含量)/對(duì)照品加入量×100%［10］。結(jié)果顯示，黃芪甲苷的加樣回收率較高，方法可行，見表5。

稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，各取5 份，加甲醇分別制成0.502 4、1.004 0、2.506 0、4.974 0、7.452 0 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法使用高效液相色譜儀測定，分別進(jìn)樣10 μl，測得峰面積［9］，見表1。計(jì)算進(jìn)樣量和峰面積的對(duì)數(shù)，繪制回歸方程，以進(jìn)樣量對(duì)數(shù)(logx)為橫坐標(biāo)，以峰面積對(duì)數(shù)(lgy)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1?；貧w方程:lgy=1.323 9 lgx+3.382 0，r=0.999 6。結(jié)果顯示，黃芪甲苷進(jìn)樣量在5.024 0 ～74.520 0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8 重復(fù)性考察

取本品，搖勻，精密量取15 ml，稱取6 份，按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測定。結(jié)果顯示，本方法的重復(fù)性較好，見表4。

2.9 加樣回收考察

取本品，搖勻，精密量取15 ml，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置后的0、2、4、8、12、16 h 使用高效液相色譜儀測定，進(jìn)樣10 μl。結(jié)果顯示，本品供試品溶液在16 h 內(nèi)檢測穩(wěn)定性較好，見表3。

表2 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of precision test

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of stability test

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of repeatability test

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of recovery test

2.10 樣品含量測定

按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下方法，對(duì)10 批樣品的黃芪甲苷含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表6。根據(jù)以上10 批樣品中黃芪甲苷含量的測定結(jié)果，結(jié)合工藝研究中的轉(zhuǎn)移率，暫定本品含黃芪以黃芪甲苷計(jì)不得少于0.10 mg/ml。以10 批樣品均值的80%作為含量低限，確定本品的含量限度，具體計(jì)算方法:(0.123 +0.188+0.192+0.106+0.108+0.108+0.107+0.124+0.121+0.176)/10 ×80% =0.108 mg/ml，此限度合理。

3 討論

以上方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該高效液相色譜法能夠用于測定芪參安胃口服液中黃芪甲苷的含量。通過幾批樣品的含量測定，可以確定本品的含量限度。本品的含量測定方法學(xué)結(jié)果為:色譜條件與系統(tǒng)應(yīng)用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-水(V ∶V =32 ∶68)為流動(dòng)相;使用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

對(duì)照品溶液的制備:取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成1.0 mg/ml 的溶液，即得。

表6 10 批樣品中黃芪甲苷的含量Tab 6 Contents of Astragaloside A in 10 batches of Qishen Anwei oral solution samples

供試品溶液的制備:精密量取本品15 ml，用水飽和正丁醇振搖提取4 次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至5 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①BCVA≥0.8；②視野正常；③眼壓正常；④無青光眼等眼病及家族史；⑤無眼部手術(shù)及外傷史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①雙眼SE＜-6 D或＞+6 D；②屈光介質(zhì)混濁影響掃描圖像的清晰度；③其他眼部疾病或全身系統(tǒng)性疾病病史；④其他視神經(jīng)、視路及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病史。

測定法:分別精密吸取對(duì)照品溶液5、15 μL，供試品溶液20 μl，注入高效液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得。

首先，以團(tuán)隊(duì)為單位進(jìn)行考核是重點(diǎn)。由于沙盤實(shí)訓(xùn)課程是以團(tuán)隊(duì)形式開展的，每位團(tuán)隊(duì)成員在模擬企業(yè)中扮演重要角色并承擔(dān)崗位職責(zé)，各成員互相配合，模擬企業(yè)才得以正常運(yùn)轉(zhuǎn)。因此，沙盤實(shí)訓(xùn)課程需要以經(jīng)營團(tuán)隊(duì)作為考核的重點(diǎn)，比如以團(tuán)隊(duì)成員參與度、團(tuán)隊(duì)最終的經(jīng)營成績排名為考核依據(jù)，對(duì)各團(tuán)隊(duì)進(jìn)行評(píng)分。將團(tuán)隊(duì)作為考核的重點(diǎn)，有利于增強(qiáng)團(tuán)隊(duì)凝聚力和集體榮譽(yù)感，有利于團(tuán)隊(duì)成員之間的相互激勵(lì)。

西南政法大學(xué)毓秀菁英學(xué)生骨干培養(yǎng)理念是以校、院兩級(jí)學(xué)生骨干為主體，秉承“博學(xué)、篤行、厚德、重法”的西政校訓(xùn)，構(gòu)筑“一個(gè)中心”、落實(shí)“兩個(gè)支點(diǎn)”、貫徹“三個(gè)融合”的毓秀菁英學(xué)生骨干培養(yǎng)模式，培養(yǎng)中國特色社會(huì)主義合格建設(shè)者和可靠接班人，探索全員、全方位育人思想政治教育新格局。

本品含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計(jì)，不得少于0.10 mg/ml。

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