航天誘變對(duì)夏枯草SP1代生物學(xué)特性和迷迭香酸含量的影響

馬 楠，齊志鴻，毛仁俊，劉峰華，劉 巖，韓蕊蓮

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津 300402)

航天誘變對(duì)夏枯草SP1代生物學(xué)特性和迷迭香酸含量的影響

馬 楠1，齊志鴻2，毛仁俊1，劉峰華2，劉 巖2，韓蕊蓮1

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津 300402)

【目的】 研究航天誘變處理對(duì)SP1代夏枯草生物學(xué)特性和迷迭香酸含量的影響，為夏枯草種質(zhì)改良和品種選育提供參考。【方法】 以神舟八號(hào)飛船搭載的夏枯草種子和地面種子(對(duì)照)為材料，在夏枯草發(fā)育過(guò)程中觀測(cè)記錄表型生長(zhǎng)指標(biāo)；在夏枯草收獲后，用高效液相色譜法檢測(cè)其干燥果穗中的迷迭香酸含量，分析航天誘變對(duì)夏枯草的影響?！窘Y(jié)果】 搭載組(SP)夏枯草的株高、主莖粗、分枝粗、果穗粗度、果穗長(zhǎng)度、果穗數(shù)、地上部分干質(zhì)量、地上部分鮮質(zhì)量、果穗干質(zhì)量、莖葉干質(zhì)量等表型指標(biāo)與對(duì)照組(CK)相比均有不同程度降低，其中分枝粗、果穗數(shù)、果穗粗度、果穗長(zhǎng)度、地上部分干鮮質(zhì)量、果穗干質(zhì)量、莖葉干質(zhì)量等指標(biāo)差異達(dá)到極顯著水平；搭載組(SP)夏枯草的抽薹期、開(kāi)花期、盛花期、成熟期均較對(duì)照推后；搭載組(SP)干燥果穗中迷迭香酸含量總體較對(duì)照組(CK)有所升高，在SP1代中檢測(cè)到6株含量極高的植株，但總體差異不顯著；搭載組SP1代夏枯草生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)了多種表型變異。【結(jié)論】 航天誘變?cè)龃罅讼目莶葜仓瓯硇偷耐蛔兟?，總體而言對(duì)夏枯草表型生長(zhǎng)具有抑制作用。

夏枯草；航天誘變；生物學(xué)特性；SP1代；迷迭香酸

夏枯草(PrunellavulgarisL.)為唇形科夏枯草屬多年生草本植物，以干燥果穗入藥，中醫(yī)認(rèn)為其具有清肝明目、消腫散結(jié)之功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，夏枯草具有增強(qiáng)免疫力、降壓降血糖和抗菌抗病毒作用[2-3]，其主要藥理活性物質(zhì)為迷迭香酸。夏枯草是一種藥食同源的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)的河南、安徽、江西等地廣泛種植[4-5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)夏枯草主要開(kāi)展了栽培技術(shù)[6-8]、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[9-12]、活性成分提取與含量分析[13-18]、藥理作用[19]等多方面的研究。隨著國(guó)內(nèi)外藥材和食品市場(chǎng)對(duì)夏枯草需求量的逐年增大，傳統(tǒng)農(nóng)家種植夏枯草的產(chǎn)量和品質(zhì)已不能滿足市場(chǎng)要求，而對(duì)夏枯草優(yōu)良品種培育的研究卻鮮有報(bào)道。

夏枯草傳統(tǒng)家種品種單一，通過(guò)常規(guī)育種途徑進(jìn)行改良的難度很大。而利用太空特殊環(huán)境進(jìn)行誘變的航天育種技術(shù)能促使植物細(xì)胞發(fā)生突變，產(chǎn)生新品種[20-22]。因此，本研究對(duì)夏枯草種子進(jìn)行了航天搭載，對(duì)誘變種子SP1代植株的表型生長(zhǎng)和迷迭香酸含量進(jìn)行了初步研究，以期為夏枯草的種質(zhì)改良和品種選育提供參考。

1 材料與方法

1．1 材 料

精選當(dāng)年優(yōu)質(zhì)夏枯草種子(天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司提供)，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)梁宗鎖教授鑒定為夏枯草(PrunellavulgarisL.)。將夏枯草種子分成2份，一份進(jìn)行太空搭載試驗(yàn)，命名為搭載組(SP)，另一份留作地面對(duì)照，命名為對(duì)照組(CK)。

1.2 儀器和試劑

Waters 1525二元高效液相色譜儀、Waters 2996 二極管陣列檢測(cè)器、Waters SunFire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Empower 2 色譜分析軟件，均購(gòu)自美國(guó)Waters公司；超純水機(jī)，購(gòu)自上海優(yōu)普科技有限公司。

色譜級(jí)甲醇，購(gòu)自Fisher scientific(Fairlawn，NJ，USA)；色譜級(jí)磷酸、無(wú)水乙醇，購(gòu)自西安試劑廠；迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品(Rosmarinic acid，批號(hào)20120809)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 種子的航天誘變方法

利用神州八號(hào)飛船搭載夏枯草種子進(jìn)行航天誘變處理。于2011-11-01 05:58:10，神州八號(hào)飛船由改進(jìn)型“長(zhǎng)征二號(hào)”F遙八火箭順利發(fā)射升空，火箭飛行583 s后，將神州八號(hào)飛船成功送入近地點(diǎn)200 km、遠(yuǎn)地點(diǎn)330 km的預(yù)定軌道，經(jīng)過(guò)397 h的軌道運(yùn)行，神州八號(hào)返回艙于2011-11-17 19:00時(shí)許返回地面。

1.4 植物生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

2012-08-20，將搭載組和對(duì)照組夏枯草種子播種于河南省確山縣石滾河鎮(zhèn)天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司夏枯草繁育基地。60 d后，將搭載組和對(duì)照組的成活幼苗分別移栽，行株距25 cm×25 cm。

在植株生長(zhǎng)過(guò)程中，統(tǒng)計(jì)搭載組108株夏枯草的表型(包括株型、葉色、花色、果穗大小等)變異狀況。記錄搭載組和對(duì)照組夏枯草單株和群體進(jìn)入抽薹期、始花期、盛花期、成熟期的時(shí)間(群體進(jìn)入時(shí)間以組內(nèi)50%植株表現(xiàn)出相應(yīng)表型的日期記)。

在2013-06-15夏枯草采收期，利用直尺和游標(biāo)卡尺觀測(cè)記錄搭載組108株及對(duì)照組30株夏枯草的株高、主莖粗、分枝粗、果穗數(shù)、果穗長(zhǎng)度、果穗粗度等表型生長(zhǎng)指標(biāo)；將采自試驗(yàn)田內(nèi)的新鮮植株迅速用自來(lái)水和蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，稱量地上部分鮮質(zhì)量；將稱完鮮質(zhì)量的植株放入105 ℃烘箱內(nèi)，恒溫保持30 min 殺青，然后將溫度降到55 ℃，烘干至恒質(zhì)量，取出后于室溫下稱量地上部分干質(zhì)量；將干燥果穗分離稱量，得果穗干質(zhì)量。

1.5 干燥果穗中迷迭香酸含量的測(cè)定

參照中國(guó)藥典2010年版[1]中的方法測(cè)定夏枯草迷迭香酸含量，色譜柱為Waters SunFire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液(體積比47∶53)，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，柱溫30 ℃。分別精密吸取0.45 g/L迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品貯備液10.0，24.9，49.5，122.0，238.1，348.8，454.5 μL于5 mL量瓶中，加乙醇至刻度，制備梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析，梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣20 μL(各梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣量分別為0.180，0.448，0.891，2.195，4.286，6.279和8.182 μg)。以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后精密吸取搭載組和對(duì)照組夏枯草供試溶液20 μL進(jìn)樣，參照曲線計(jì)算迷迭香酸含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計(jì)航天搭載夏枯草SP1代出現(xiàn)的表型變異情況和突變率；利用IBM SPSS Statistics 19.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)測(cè)得的搭載組和對(duì)照組所有表型生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行比較，分析其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 航天搭載對(duì)夏枯草形態(tài)特征的影響

表1表明,航天搭載處理后的夏枯草在株高、主莖粗和分枝粗上呈現(xiàn)出表型生長(zhǎng)減弱的趨勢(shì)，比對(duì)照組株高減小5.36%、主莖粗減小4.34%，但是差異均未達(dá)到顯著性水平(P>0.05)；搭載組分枝粗與對(duì)照組相比極顯著降低(P<0.01)，比對(duì)照組下降0.14 mm。結(jié)果說(shuō)明,航天誘變對(duì)夏枯草的表型形態(tài)起到了抑制作用。

表1 航天搭載對(duì)夏枯草形態(tài)特征的影響Table 1 Effects of space mutation on the morphological traits of Prunella vulgaris L.

注：**和**分別表示SP與CK存在顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)差異(t檢驗(yàn))。下表同。

Note:* and ** represent significances between space mutation treatment and control atP=0.05 andP=0.01 level byt-test,respectively.The same below.

2.2 航天搭載對(duì)夏枯草果實(shí)表型的影響

航天搭載對(duì)夏枯草果實(shí)表型的影響結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，經(jīng)過(guò)航天搭載后的夏枯草果穗發(fā)育狀況欠佳，相比于地面對(duì)照結(jié)穗數(shù)目少、穗頭短且細(xì)小，果穗數(shù)減少15.52%，果穗長(zhǎng)度降低6.09%，果穗粗度降低2.90%，且這3項(xiàng)指標(biāo)的變化均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，說(shuō)明航天誘變從總體上削弱了夏枯草的結(jié)實(shí)能力。航天搭載后的夏枯草果穗數(shù)變化幅度很大，這可能是由于果穗是夏枯草最主要的器官，航天搭載對(duì)其影響較大，既出現(xiàn)了果穗數(shù)很少的誘變株，也有果穗數(shù)很多的誘變株。

表2 航天搭載對(duì)夏枯草果實(shí)表型的影響Table 2 Effects of space mutation on the fruit characters of Prunella vulgaris L.

2.3 航天搭載對(duì)夏枯草生物量的影響

果穗是夏枯草最主要的器官，果穗的數(shù)目和大小直接影響果穗質(zhì)量。由于搭載組的果穗變少、變小，因而其果穗干質(zhì)量較對(duì)照組減小。一般情況下，夏枯草每個(gè)分枝上著生5～7個(gè)果穗，果穗發(fā)育情況可以反映莖稈的分蘗情況，莖稈的分蘗又影響著莖葉干質(zhì)量。由表3可知，搭載組莖葉干質(zhì)量較對(duì)照組減少21.29%，果穗干質(zhì)量較對(duì)照組下降20.12%，2組的果穗和莖葉干質(zhì)量差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)，表明航天搭載對(duì)夏枯草果穗和莖葉的發(fā)育均起到抑制作用。

果穗和莖葉的變化，最終導(dǎo)致地上部分發(fā)生變化。由表3可知，搭載組夏枯草的地上部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量比對(duì)照組分別極顯著減少了23.62%和20.81%(P<0.01)。表明航天誘變處理對(duì)夏枯草表型生長(zhǎng)有減弱作用，最終體現(xiàn)為植株生物量顯著減少。

2.4 航天搭載對(duì)夏枯草生長(zhǎng)發(fā)育期的影響

航天搭載對(duì)夏枯草的影響既體現(xiàn)在量化指標(biāo)上，又體現(xiàn)在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的每個(gè)階段。由表4 可知，對(duì)照組夏枯草比搭載組更早進(jìn)入抽薹期、開(kāi)花期、盛花期、成熟期，其組內(nèi)植株最早進(jìn)入的抽薹、開(kāi)花、盛花、成熟期分別在04-14、04-28、05-13和06-01，搭載組相應(yīng)的日期分別為04-14、05-02、05-16和06-02；隨著夏枯草的生長(zhǎng)發(fā)育，搭載組平均物候期變化遲于對(duì)照組4～5 d。說(shuō)明航天搭載處理對(duì)夏枯草生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟過(guò)程具有一定的延緩作用，且搭載組夏枯草單株抽薹、開(kāi)花、盛花、成熟的時(shí)間跨度較大，發(fā)育過(guò)程不整齊，這可能是由于搭載組(SP)植株數(shù)目較多，也可能是由于航天誘變擴(kuò)大了夏枯草物候期的變異幅度。

表3 航天搭載對(duì)夏枯草生物量的影響
Table 3 Effects of space mutation on the biomass of Prunella vulgaris L.

組別Group地上鮮質(zhì)量/(g·株-1)Freshweightoftheaerialparts地上干質(zhì)量/(g·株-1)Dryweightoftheaerialparts果穗干質(zhì)量/(g·穗-1)Dryweightofclusters莖葉干質(zhì)量/(g·株-1)DryweightofstemsandleavesSP75.55±28.93**30.10±9.58**12.47±4.55**17.63±5.31**CK98.92±23.1438.01±9.8815.61±4.3822.40±5.98

表4 航天搭載對(duì)夏枯草生長(zhǎng)發(fā)育期的影響Table 4 Effects of space mutation on the phenological phase of Prunella vulgaris L.

2.5 航天搭載對(duì)夏枯草干燥果穗中迷迭香酸含量的影響

經(jīng)測(cè)算,在進(jìn)樣量為0.18～8.18 μg時(shí)，迷迭香酸的峰面積(Y)與進(jìn)樣量(X)之間線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=3×109X-321 678(r2=0.999 5)。由此計(jì)算出部分搭載組和對(duì)照組夏枯草干燥果穗中迷迭香酸含量，結(jié)果見(jiàn)表5(每組列10株數(shù)據(jù))。部分材料的高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

表5 航天搭載對(duì)夏枯草干燥果穗中迷迭香酸含量的影響Table 5 Effects of space mutation on the rosmarinic acid in Prunella vulgaris L. mg/g

從表5可以看出，對(duì)照組(CK)夏枯草植株由于沒(méi)有受到太空強(qiáng)輻射和微重力等因素的影響，因而組內(nèi)各植株迷迭香酸含量的差異不大，在10 mg/g左右；搭載組(SP)植株由于對(duì)宇宙環(huán)境的適應(yīng)能力不同，迷迭香酸含量出現(xiàn)較為明顯的變異，如部分植株的迷迭香酸含量極低，只有1.1 mg/g；也有6株植株的迷迭香酸含量異常增高，如SP68植株，其迷迭香酸含量達(dá)到20.3 mg/g，約為平均水平的2倍，可以視為迷迭香酸含量增高的有利突變植株。航天誘變處理后，夏枯草干燥果穗中迷迭香酸含量變異幅度增大，但差異均未達(dá)到顯著水平，其平均水平由對(duì)照的10.1 mg/g增加到11.9 mg/g，增加了16.41%。

圖1 部分夏枯草干燥果穗中迷迭香酸含量的高效液相色譜圖A.迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品；B.對(duì)照組；C.搭載組；1.迷迭香酸

2.6 航天搭載夏枯草SP1代的表型變異情況

在對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)表型變異植株。從表6可以看出，SP1代108株夏枯草中，有7株莖稈顏色變淺，變異率為6.48%；另有11株莖稈光滑無(wú)毛，變異率為10.19%；有5株花色變?yōu)榉郯咨蚪醢咨?，變異率?.63%；2株葉片顏色變淺，變異率為1.85%。但在果穗苞片被毛、種子大小等表型上沒(méi)有明顯的變異。由此可知，航天誘變?cè)龃罅讼目莶葜仓瓯硇屯蛔兊膸茁省?/p>

表6 航天搭載夏枯草SP1代的變異情況Table 6 Variation of SP1 generation of Prunella vulgaris L.

3 討 論

整體而言，航天誘變處理對(duì)夏枯草表型生長(zhǎng)起到了抑制作用，削弱了夏枯草的結(jié)實(shí)能力，最終體現(xiàn)為植株生物量大幅度縮減；航天誘變處理的SP1代夏枯草普遍生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程延遲。這與在番茄[23]、須苞石竹[24]、黃芩[25]、桔梗[26]等上的研究結(jié)果一致。其原因可能是輻射誘變對(duì)染色體或DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生傷害而導(dǎo)致突變，致使植株生長(zhǎng)發(fā)育受到明顯抑制[27]，也可能是航天環(huán)境的微重力和強(qiáng)輻射影響了細(xì)胞分裂和信號(hào)傳遞等生理生化過(guò)程所致[23-29]。

就個(gè)體而言，航天誘變?cè)龃罅讼目莶葜仓瓯硇偷耐蛔兟?，但航天誘變對(duì)每一株夏枯草的誘變效果不同，在SP1代夏枯草中出現(xiàn)了不同形態(tài)表型變異的植株，如出現(xiàn)了個(gè)體大、果穗多的株型增大植株，也出現(xiàn)了迷迭香酸含量極高的高表達(dá)植株。

夏枯草以其干燥果穗入藥，增加果穗產(chǎn)量是育種的最終目的。植株的光合作用和有效成分的合成直接影響了果穗的生長(zhǎng)發(fā)育。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，航天誘變使夏枯草的結(jié)實(shí)能力下降，這可能是因?yàn)樵诖钶d過(guò)程中，夏枯草種子受到了空間環(huán)境脅迫，進(jìn)而產(chǎn)生了生理?yè)p傷。

迷迭香酸作為夏枯草主要的藥理活性物質(zhì)，是否能產(chǎn)生更多迷迭香酸是夏枯草育種的一項(xiàng)重要考察指標(biāo)。本試驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，搭載組有6株夏枯草干燥果穗迷迭香酸含量極高，這可能是由太空失重環(huán)境造成基因表達(dá)發(fā)生變異而引起的。本試驗(yàn)獲得的優(yōu)良植株為后續(xù)的育種工作提供了優(yōu)質(zhì)材料。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，航天誘變擴(kuò)大了夏枯草各株型表型的變異譜。但表型受生物基因型和環(huán)境兩方面的影響，是基因決定的性狀在環(huán)境作用下的具體表現(xiàn)，因此表型變異不一定是由于基因型變異引起的，不同的表型并非都有不同的基因型。因此SP1代夏枯草中出現(xiàn)的表型變異不一定能夠在子代穩(wěn)定遺傳。多篇報(bào)道表明，航天誘變材料SP2代更適用于育種材料的選擇[30]，對(duì)其進(jìn)行自交繁殖、品系鑒定、區(qū)域化試驗(yàn)等后，在SP3、SP4代中才有可能獲得遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)良突變系。因此，在未來(lái)幾年的夏枯草育種研究過(guò)程中，需將基因型選擇與表型選擇相結(jié)合，提高選擇效率。此外，利用分子標(biāo)記技術(shù)分析材料的遺傳物質(zhì)多樣性，也可以加快育種進(jìn)程。

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Effects of space mutation on biological characteristics and rosmarinic acid content of SP1PrunellavulgarisL.

MA Nan1,QI Zhi-hong2,MAO Ren-jun1,LIU Feng-hua2, LIU Yan2,HAN Rui-lian1

(1CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2TianjinTaslyModernTCMResourcesCO.LTD,Tianjin300402,China)

【Objective】 This study investigated the effects of space mutation on biological traits and rosmarinic acid content ofPrunellavulgarisL.to provide references for germplasm improvement and variety breeding.【Method】 Using the seeds carried by Shenzhou Ⅷ spacecraft and the seeds stayed on earth ofPrunellavulgarisL.as materials,growth indexes of phenotype were observed and rosmarinic acid contents in dry ears were measured by high performance liquid after harvesting.Then the differences between these two groups were compared to identify the effects of space mutation onPrunellavulgarisL.【Result】 General reductions in plant height,branch width,cluster length,cluster width,cluster number,dry weight of the aerial parts,fresh weight of the aerial parts,dry weight of clusters,and dry weight of stems and leaves were found when comparing the mutagenic treatment group (SP) with the control (CK).The differences in branch width,cluster number,fresh weight of the aerial parts,dry weight of the aerial parts and clusters were extremely significant.The bolting stage,initial blooming stage,full blooming stage,and maturing stage of SP were later than those of CK.The rosmarinic acid content of SP was larger than CK.Six plants with high rosmarinic acid contents were detected in SP1generation,but the differences were insignificant. Besides,a variety of phenotypic variations were observed in SP1generation.【Conclusion】 Space mutation treatment increased the phenotype mutation rate and inhibited the growth ofPrunellavulgarisL.

PrunellavulgarisL.;space mutation treatment;biological characteristics;SP1generation;rosmarinic acid

時(shí)間:2015-08-05 08:57

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.025

2014-02-24

陜西省科技統(tǒng)籌項(xiàng)目(2012KTCL02-07)

馬 楠(1989-)，女，河北保定人，在讀碩士，主要從事藥用植物學(xué)研究。E-mail:mnmemory@126.com

韓蕊蓮(1962-)，女，陜西扶風(fēng)人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中草藥規(guī)范化栽培理論與技術(shù)研究。 E-mail:hanrl@nwsuaf.edu.cn

S567.23

A

1671-9387(2015)09-0178-07

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