中國水仙ZDS反義基因表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因植株的獲得

馮 瑩，周 翔，潘騰飛，郭志雄，潘東明

(1 泉州師范學(xué)院 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362000；2 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝產(chǎn)品貯運保鮮研究所，福建 福州 350002)

中國水仙ZDS反義基因表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因植株的獲得

馮 瑩1,2，周 翔2，潘騰飛2，郭志雄2，潘東明2

(1 泉州師范學(xué)院 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362000；2 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝產(chǎn)品貯運保鮮研究所，福建 福州 350002)

【目的】 構(gòu)建中國水仙ZDS反義基因表達(dá)載體，為進一步研究ZDS基因的功能、改良中國水仙花色、培育花色新品種提供參考?！痉椒ā?以中國水仙花為材料，采用RT-PCR方法克隆其ZDS基因，通過PCR、雙酶切、連接等方法將ZDS基因反向互補插入到pCAMBIA1301雙GUS植物表達(dá)載體中，構(gòu)建ZDS反義基因表達(dá)載體P1301-ZDS，再通過凍融法將重組質(zhì)粒P1301-ZDS導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ZDS反義基因轉(zhuǎn)化中國水仙帶盤鱗莖，通過直接、間接、延遲篩選法3種方法對侵染的帶盤鱗莖進行抗性篩選，采用直接篩選法和逐步降低選擇壓(質(zhì)量濃度)方法對抗性鱗莖進行增殖和分化培養(yǎng)，采用GUS組織化學(xué)和hyg基因的PCR檢測方法對中國水仙轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定?！窘Y(jié)果】 成功構(gòu)建了中國水仙ZDS反義基因表達(dá)載體P1301-ZDS；延遲篩選法為根癌農(nóng)桿菌侵染帶盤鱗莖的有效篩選方法，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到28.54%；逐步降低選擇壓法為抗性小鱗莖增殖和分化培養(yǎng)的有效培養(yǎng)方法；將65株抗性小苗在1/2 MS+0.2 mg/L NAA+10 mg/L Hyg +100 mg/L Cef 生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得了12株再生植株，轉(zhuǎn)化率達(dá)到18.46%；檢測結(jié)果表明，10株抗性植株hyg基因和gus基因已經(jīng)整合到中國水仙的基因組中并穩(wěn)定表達(dá)；1株抗性植株穩(wěn)定表達(dá)hyg基因但gus基因未穩(wěn)定表達(dá)，1株抗性植株2個基因均未穩(wěn)定表達(dá)。【結(jié)論】 構(gòu)建中國水仙ZDS反義基因表達(dá)載體并侵染中國水仙帶盤鱗莖，經(jīng)抗性篩選后獲得12株中國水仙轉(zhuǎn)基因植株。

中國水仙；ZDS基因；載體構(gòu)建；遺傳轉(zhuǎn)化

中國水仙(Narcissustazettavar.Chinensis)是冬季室內(nèi)陳設(shè)花卉之一[1]，具有重要的觀賞價值和經(jīng)濟價值[2]，是福建省出口創(chuàng)匯的重要花卉之一。‘金盞銀臺’和‘玉玲瓏’是中國水仙2個栽培品種，花色單一。由于中國水仙為同源三倍體，用有性雜交的方式改良和選育花色新品種較為困難，這使得中國水仙的觀賞價值和經(jīng)濟價值受到限制。花色是觀賞植物最重要的品質(zhì)指標(biāo)之一，主要由類黃素、類胡蘿卜素、甜菜色素等三大色素決定[3]。目前，多采用基因工程技術(shù)改良或培養(yǎng)中國水仙花色新品種，如戴藝民等[4]從矮牽牛、牽?；ㄖ锌寺〕鯤f2(編碼藍(lán)色基因F3′5′H)、dfr基因，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入中國水仙愈傷組織，獲得3株陽性植株；鄒清成等[5]從中國水仙花瓣中克隆得到PSY基因，構(gòu)建PSY反義基因表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)入中國水仙，獲得抗性芽?？梢?，中國水仙花色新品種改良主要集中于類胡蘿卜素途徑相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究，而該途徑中其他花色調(diào)控基因的研究尚未見報道。

ζ-胡蘿卜素脫氫酶(Zeta-carotenedesaturase，ZDS)是類胡蘿卜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，是催化ζ-胡蘿卜素脫氫生成類胡蘿卜素合成途徑中第一個有色分子——鏈孢紅素(淡黃色)，同時也是催化ζ-胡蘿卜素向番茄紅素轉(zhuǎn)化過程中的酶[6]。ZDS對植物花和果實顯色具有重要作用，是植物從無色到有色的關(guān)鍵調(diào)控酶之一[7-8]。目前，ZDS基因已從番茄[9]、向日葵[10]、龍膽草[11]、草莓[12]、甜橙[13]等植物中分離并克隆。鐘嫻等[14]以中國水仙花為材料，采用RACE方法獲得中國水仙ZDS基因，qRT-PCR結(jié)果表明，中國水仙副冠中ZDS基因表達(dá)量高于花瓣，而且隨著顏色加深，其表達(dá)量升高，最終認(rèn)為ZDS基因?qū)χ袊苫ㄉ哂幸欢ǖ恼{(diào)控作用。本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建中國水仙花ZDS反義基因表達(dá)載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ZDS反義基因轉(zhuǎn)入中國水仙，獲得轉(zhuǎn)基因植株,以期為進一步研究ZDS基因的功能、改良中國水仙花色、培育花色新品種提供技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 材 料

中國水仙花、轉(zhuǎn)化受體材料中國水仙帶盤鱗莖、根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105、含有g(shù)us報告基因和hyg抗性篩選基因的pCAMBIA1301雙GUS植物表達(dá)載體，均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯運保鮮研究所提供。

多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒購于百泰克公司；TransScriptⅡ First-strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購于北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ、dNTP、Prime STAR HS DNA polymerase、pMD18-T克隆載體購于寶生物工程有限公司；卡那霉素(Km)、利福平(Rif)、潮霉素(Hyg)、頭孢霉素(Cef)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)購于生工生物工程有限公司。

1.2 ZDS基因的克隆

以中國水仙花為材料，按照多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒說明書提取其總RNA。以總RNA為模板，按照TransScriptⅡ First-strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

根據(jù)Genkank中公布的中國水仙ZDS基因全長序列(GenBank登錄號為：EU573238)和植物表達(dá)載體pCAMBIA1301酶切位點，設(shè)計2條引物，分別為P1：5′-GCGAGCTCATGGCTTCTTTCACTT-GTTTAATTCATTCT-3′；P2：5′-ACTCTAGATT-ATACGAGGCTCAGCTCATCGATATGTTAG-3′。以cDNA為模板，以P1、P2為引物進行PCR擴增,PCR擴增反應(yīng)體系為：1.0 μL cDNA模板，10 mmol/L上、下游引物各0.5 μL，5.0 μL 5×prime STAR buffer，0.5 μL dNTP Mix(10.0 mmol/L)，0.25 μL Prime STAR HS DNA polymerase，補ddH2O至總體積為25 μL。PCR擴增反應(yīng)程序為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。

1.3 pGM-ZDS的構(gòu)建

將回收的目的條帶連接到pMD18-T克隆載體后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆，挑取單菌落搖菌4～6 h后，對菌液進行PCR檢測，將PCR檢測正確的菌液送博尚生物技術(shù)有限公司(上海)測序，測序結(jié)果采用DNAMAN 6軟件分析。選取與目的基因一致的單克隆菌液振蕩培養(yǎng)過夜，按照質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒DNA，并命名為pGM-ZDS。

1.4 P1301-ZDS反義基因表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

用2種限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ分別對質(zhì)粒pGM-ZDS和pCAMBIA1301進行雙酶切，并回收目的片段。將含ZDS基因的目的片段反向互補插入到已雙酶切的pCAMBIA1301質(zhì)粒大片段中構(gòu)建ZDS反義基因表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受細(xì)胞DH5α，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑單菌落搖菌4～6 h后進行PCR檢測(引物為P1、P2)，獲得陽性克隆。取正確的單克隆菌液搖菌后提取質(zhì)粒DNA(命名為P1301-ZDS)，進行XbaⅠ和SacⅠ雙酶切驗證。

采用液氮凍融法將重組質(zhì)粒P1301-ZDS導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過篩選獲得單克隆。取200 μL單克隆菌液放入EP中，100 ℃沸水浴15 min，以此菌液為模板進行PCR檢測(引物為P1、P2)，獲得重組質(zhì)粒。

1.5 中國水仙ZDS反義基因?qū)ПP鱗莖的轉(zhuǎn)化

挑取EHA105根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于含100 mg/L 卡那霉素和150 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min振蕩活化培養(yǎng)過夜。將活化的菌液在5 000 r/min下離心10 min，用MN基本培養(yǎng)基[15]+2.0 mg/L 6-BA +0.6 mg/L NAA+60 g/L白糖的液體培養(yǎng)基重懸菌體，最后將中國水仙帶盤鱗莖加入菌液中，28 ℃、120 r/min振蕩數(shù)分鐘。取出帶盤鱗莖,置于無菌濾紙上吸干后接種于MN+2.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA固體培養(yǎng)基上，25 ℃下暗培養(yǎng)7 d。

1.6 轉(zhuǎn)ZDS反義基因中國水仙帶盤鱗莖的篩選

帶盤鱗莖經(jīng)過根癌農(nóng)桿菌侵染除菌后進行抗性篩選。試驗分別采用直接、延遲和間歇篩選法進行篩選。試驗每處理重復(fù)3次,每重復(fù)5瓶,每瓶接種20～25個帶盤鱗莖,結(jié)果取3次重復(fù)的平均值。統(tǒng)計觀察帶盤鱗莖的生長狀況、褐變程度及通過不同篩選方法獲得的轉(zhuǎn)化效率。培養(yǎng)基為MN+2.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA。

直接篩選采用2種方法進行：(1)共培養(yǎng)除菌后，將帶盤鱗莖直接置于附加20 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基中連續(xù)篩選3個月；(2)共培養(yǎng)除菌后，將帶盤鱗莖置于Hyg質(zhì)量濃度逐步提高(5，10，15，20 mg/L)的培養(yǎng)基中進行篩選，每種質(zhì)量濃度培養(yǎng)10 d。

延遲篩選法：帶盤鱗莖除菌后培養(yǎng)于含100 mg/L Cef 的培養(yǎng)基中進行恢復(fù)生長， 7 d后置于附加20 mg/L Hyg的培養(yǎng)基中篩選，每隔10 d左右轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選，共篩選9次。

間歇篩選法：帶盤鱗莖除菌后轉(zhuǎn)移到添加100 mg/L Cef和20 mg/L Hyg的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，再轉(zhuǎn)移到無選擇壓培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)10 d，如此反復(fù)交替進行5次。

1.7 轉(zhuǎn)ZDS反義基因中國水仙抗性小鱗莖的增殖與分化

將篩選培養(yǎng)3個月后獲得的抗性小鱗莖進行增殖與分化培養(yǎng)。試驗采用直接篩選法和逐漸降低Hyg選擇壓(質(zhì)量濃度)法進行培養(yǎng)。直接篩選法是將抗性小鱗莖轉(zhuǎn)至MN+2.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+20 mg/L Hyg培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每10 d左右轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，共篩選6次。逐漸降低Hyg選擇壓法是將抗性小鱗莖置于Hyg 質(zhì)量濃度逐步降低(20，15，10 mg/L)的MN+2.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每種質(zhì)量濃度培養(yǎng)10 d；再將抗性小鱗莖轉(zhuǎn)至MN+2.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+5 mg/L Hyg培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每隔10 d左右轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，共篩選3次。

1.8 中國水仙轉(zhuǎn)ZDS反義基因植株的獲得

選擇苗齡30 d且長勢一致的未轉(zhuǎn)化小苗,分別接種于含有不同質(zhì)量濃度(0(對照，CK)，5，10，15，20 mg/L)Hyg的1/2 MS+0.2 mg/L NAA+100 mg/L Cef壯苗生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。30 d后，觀察植株的生根情況和苗的長勢。每瓶接種3株，每種處理10瓶為一個重復(fù)，每處理重復(fù)3次，結(jié)果取3次重復(fù)的平均值。

將存活的抗性小苗培養(yǎng)于1/2 MS+0.2 mg/L NAA+10 mg/L Hyg+100 mg/L Cef的壯苗生根篩選培養(yǎng)基中，每隔20 d轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3次。觀察植株的生根情況。

1.9 中國水仙轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

1.9.1 GUS組織化學(xué)法鑒定 將轉(zhuǎn)ZDS反義基因的中國水仙再生植株(12株)的葉片剪下后置于X-Gluc工作液中進行組織化學(xué)檢測，37 ℃ 暗處理16 h，以正常中國水仙葉片為對照；再用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇進行脫色，拍照并觀察染色情況。

1.9.2hyg基因的PCR檢測 利用微量DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA，貯存于-40 ℃?zhèn)溆?。根?jù)GenBank公布的pCAMBIA1301序列中hyg基因序列，采用Oligo 6.0軟件設(shè)計PCR特異引物，序列分別為H1：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′和H2：5′-CTATTTCTTTGCCCT CGGACGAGT-3′。引物由博尚生物技術(shù)有限公司(上海)合成。PCR擴增反應(yīng)體系為： cDNA模板1.0 μL，10 mmol/L上、下游引物各0.5 μL，5×prime STAR buffer 5.0 μL，dNTP Mix(10.0 mmol/L) 0.5 μL，Prime STAR HS DNA polymerase 0.25 μL，補ddH2O至總體積為25 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增反應(yīng)的結(jié)果，紫外燈下觀察并照相，以未轉(zhuǎn)化植株為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZDS基因的獲得

以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以P1、P2為引物對ZDS基因進行PCR擴增，獲得了約為1 800 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 重組質(zhì)粒pGM-ZDS的鑒定

重組質(zhì)粒pGM-ZDS PCR檢測結(jié)果顯示，擴增到約為1 800 bp的條帶(圖2-A)。利用XbaⅠ和SacⅠ對重組質(zhì)粒pGM-ZDS的DNA進行雙酶切，結(jié)果獲得了約1 731和2 600 bp的條帶(圖2-B)。

測序結(jié)果(圖3)表明，獲得的ZDS基因片段含有一個1 725 bp完整開放閱讀框，編碼574個氨基酸，與GenBank已登錄的中國水仙ZDS基因序列相似度達(dá)到99%。

圖1 中國水仙ZDS基因的PCR擴增M.5 000 bp DNA Marker；1.ZDS基因

圖2 pGM-ZDS的 PCR(A)和雙酶切檢測(B)M1.5 000 bp DNA Marker;M2.15 000 bp DNA Marker;1.pGM-ZDS PCR產(chǎn)物;2.pGM-ZDS XbaⅠ和SacⅠ雙酶切產(chǎn)物

圖3 中國水仙ZDS基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig.3 Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence forZDSinNarcissustazettavar.Chinensis

2.3 重組質(zhì)粒P1301-ZDS的PCR檢測和雙酶切鑒定

以重組質(zhì)粒P1301-ZDS菌液作為模板，P1、P2為引物進行PCR反應(yīng)。電泳檢測結(jié)果表明，重組質(zhì)粒擴增出1 741 bp的目的片段(圖4)。

提取PCR擴增初步確定為陽性克隆的質(zhì)粒DNA并進行XbaⅠ和SacⅠ雙酶切，結(jié)果獲得了約1 731 bp和14 kb的條帶。

圖4 重組質(zhì)粒P1301-ZDS的PCR檢測M1.2 000 bp DNA Marker;1.重組質(zhì)粒P1301-ZDS PCR 產(chǎn)物

2.4 重組質(zhì)粒P1301-ZDS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的檢測

以單克隆菌液作為模板，用P1、P2為引物進行PCR反應(yīng)，結(jié)果擴增出1條1 741 bp的特異性片段(圖5)，表明P1301-ZDS 已成功轉(zhuǎn)化入EHA105根癌農(nóng)桿菌中。

圖5 重組質(zhì)粒P1301-ZDS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR檢測M．2 000 bp DNA Marker；1.重組質(zhì)粒P1301-ZDS 轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌的PCR產(chǎn)物

2.5 不同篩選方法對中國水仙抗性小鱗莖的篩選效果

帶盤鱗莖除菌后采用4種方法篩選抗性小鱗莖，結(jié)果見表1。從表1可以看出，不同篩選方法下抗性小鱗莖的獲得率和褐化率不同，在直接篩選方法(1)中，帶盤鱗莖生活力隨著篩選時間的延長而降低，褐化率增加，與其他處理呈顯著差異，其褐化率和抗性小鱗莖獲得率分別是延遲篩選法的33.25和0.19倍。從抗性小鱗莖獲得率和褐化率角度而言，4種篩選方法的優(yōu)劣順序依次為延遲篩選法、間歇篩選法、直接篩選方法(2)、直接篩選方法(1)。

表1 不同篩選方法對中國水仙Hyg抗性小鱗莖篩選效果的影響Table 1 Effect of different selecting methods on selection of Hyg resistant bulbs in Narcissus tazetta var.Chinensis

注：*褐化率=褐化小鱗莖的總數(shù)/篩選的帶盤鱗莖總數(shù)×100%；抗性小鱗莖獲得率=經(jīng)過3個月篩選后獲得的抗性小鱗莖總數(shù)/篩選的帶盤鱗莖總數(shù)×100%。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Browning rate equals to the number of browned bulbs/ the number of selected bulbs×100% and the obtained rate of resistant bulbs equals to the number of resistant bulbs selected for 3 months/ the number of selected bulbs×100%.Different lowercase letters in each column mean significant difference (P<0.05).

2.6 中國水仙抗性小鱗莖的增殖與分化培養(yǎng)

在直接篩選法培養(yǎng)過程中，抗性小鱗莖的增殖比較緩慢，20 d左右才開始慢慢生長，35 d左右部分抗性小鱗莖的葉子黃化、枯萎，生命活力衰退。在逐漸降低Hyg選擇壓方法中，抗性小鱗莖在Hyg為10 mg/L逐漸恢復(fù)生長(圖6)，待其質(zhì)量濃度降至5 mg/L時，抗性小鱗莖開始繁殖小鱗莖，故在增殖與分化培養(yǎng)時，可通過逐步降低Hyg質(zhì)量濃度的方式進行培養(yǎng)。

2.7 中國水仙轉(zhuǎn)基因株系的生根培養(yǎng)

結(jié)果(表2)顯示，當(dāng)Hyg質(zhì)量濃度超過5 mg/L，小鱗莖的生根率為0，且隨其質(zhì)量濃度的增加，葉子發(fā)生白化現(xiàn)象的時間越來越早。由此確定抗性小鱗莖生根培養(yǎng)基中Hyg的適宜選擇壓為10 mg/L。

圖6 中國水仙Hyg抗性小鱗莖的增殖與分化培養(yǎng)(Hyg質(zhì)量濃度為10 mg/L)Fig.6 Multiplication and differentiation of Hyg resistant bulbs in Narcissus tazetta var.Chinensis(Hyg concentration was 10 mg/L)

表2 潮霉素(Hyg)對中國水仙小鱗莖生根的影響Table 2 Effect of hygromycin on root growth of bulbs in Narcissus tazetta var.Chinensis

抗性小鱗莖經(jīng)篩選培養(yǎng)獲得了65株抗性小苗，將其培養(yǎng)于1/2 MS+0.2 mg/L NAA+10 mg/L Hyg+100 mg/L Cef 生根培養(yǎng)基中，共有12株小鱗莖生根(圖7)，生根率達(dá)18.46%，且根的長勢相對較好，小苗整體生長也較好。試驗每隔20 d更換1次培養(yǎng)基，同時剔除白化苗。

2.8 中國水仙轉(zhuǎn)基因株系的鑒定

2.8.1 GUS組織化學(xué)法檢測 將中國水仙未轉(zhuǎn)化植株和12株抗性植株的葉片進行組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)化植株葉片未見藍(lán)色(圖8-A)；12株抗性植株中有10株葉片內(nèi)部或切口處呈藍(lán)色(圖8-B)，2株葉片未出現(xiàn)藍(lán)色(圖8-C)。由此初步推測，葉片內(nèi)部或切口處呈藍(lán)色的10株抗性植株為轉(zhuǎn)基因植株。

2.8.2hyg基因的PCR檢測 對對照植株葉片以及12株抗性植株進行hyg基因的PCR檢測，結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)化植株(對照)無條帶，12株抗性植株中11株都有條帶，1株無條帶(圖9)。

對12株抗性植株的GUS組織化學(xué)檢測和PCR檢測結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)，10株抗性植株葉片GUS組織化學(xué)檢測與PCR檢測結(jié)果一致；2株抗性植株不能穩(wěn)定表達(dá)GUS，但其中1株P(guān)CR檢測結(jié)果有目的條帶，1株無目的條帶。這說明有11株抗性植株為轉(zhuǎn)基因植株，hyg基因已經(jīng)整合到中國水仙的基因組中并穩(wěn)定表達(dá)。

圖7 轉(zhuǎn)ZDS反義基因中國水仙Hyg抗性小鱗莖的生根培養(yǎng)

3 討 論

適宜的篩選方法既可提高遺傳轉(zhuǎn)化效率,也可降低篩選過程中褐化的發(fā)生。馮瑩等[16]對石斛蘭抗性原球莖篩選方法的研究表明，農(nóng)桿菌侵染后的石斛蘭原球莖除菌后，先置于附加100 mg/L Cef的增殖培養(yǎng)基中恢復(fù)生長20 d，再采用逐漸提高Km選擇壓濃度的延遲篩選法是有效的篩選途徑，這與本研究的結(jié)果一致，也與Yang等[17]、Chai等[18]、黃雙龍[19]的研究結(jié)果一致。本研究采用直接篩選法篩選抗性體時不僅褐化率高，而且擬轉(zhuǎn)化效率較低；而延遲篩選方法的褐化率非常低。這可能是由于石斛蘭和中國水仙都屬于單子葉植物，在外源基因整合到植株基因組并進行功能表達(dá)的過程中，植株受到農(nóng)桿菌和抗生素的毒害，導(dǎo)致其生活力降低，適宜時間的延遲篩選，可使植株恢復(fù)生活力，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠抵抗抗生素的毒害作用。

圖8 轉(zhuǎn)ZDS反義基因中國水仙植株葉片的GUS組織化學(xué)檢測A.對照;B.呈藍(lán)色的轉(zhuǎn)ZDS反義基因中國水仙植株;C.未呈藍(lán)色的轉(zhuǎn)ZDS反義基因中國水仙植株

圖9 轉(zhuǎn)ZDS反義基因中國水仙植株的hyg 基因的PCR檢測

前人研究認(rèn)為，抗性體在不同篩選培養(yǎng)階段對選擇壓的要求不同[14,20]，這與本研究的結(jié)果一致。中國水仙抗性小鱗莖篩選Hyg質(zhì)量濃度為20 mg/L，抗性小苗生根時采用10 mg/L Hyg篩選。經(jīng)過抗性篩選和抗性生根篩選獲得12株轉(zhuǎn)ZDS反義基因植株，12株植株中有2株的GUS組織化學(xué)檢測結(jié)果與hyg基因PCR檢測結(jié)果不一致，其中1株植株的GUS組織化學(xué)檢測結(jié)果未顯示藍(lán)色但PCR檢測到hyg基因目的條帶，1株植株的GUS組織化學(xué)檢測結(jié)果未顯示藍(lán)色且PCR也未檢測到hyg基因目的條帶。這可能是由于gus基因在整合基因組中或在轉(zhuǎn)錄翻譯過程中出現(xiàn)丟失，導(dǎo)致其不表達(dá)；2個基因均未檢測到，可能是由于gus、hyg基因出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。但具體是何種原因?qū)е略摤F(xiàn)象，仍需要進一步研究。

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Construction of expression vector withZDSantisense gene and regeneration of transgenic plants ofNarcissustazettavar.Chinensis

FENG Ying1,2,ZHOU Xiang2,PAN Teng-fei2, GUO Zhi-xiong2,PAN Dong-ming2

(1SchoolofResourceandEnvironmentalScience,QuanzhouNormalUniversity,Quanzhou,Fujian362000,China；2InstituteofPostharvestScienceandTechnologyofHorticulturalProducts,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

【Objective】 This study constructed expression vector ofZDSantisense gene to provide reference for studying function ofZDSgene,improving and cultivating new color varieties ofNarcissustazettavar.Chinensis.【Method】ZDSgene was cloned from flower with RT-RCR method,andZDSgene was reversely inserted into plant expression vector pCAMBIA1301 with double GUS by PCR,double digestion and connection method to obtaining expression vector P1301-ZDS withZDSantisense gene.Then recombinant plasmid P1301-ZDS was transformed intoAgrobacteriumthrough freeze-thawing method.ZDSantisense gene was transformed into bulbs byAgrobacterium-mediated transformation method and resistant bulbs were selected by direct selection method,indirect selection method and intermittent selection method.The multiplication and differentiation of resistant bulbs were cultured with direct selection method and gradual reduction of hyg concentration method,and transgenic plants were identified by GUS histochemical assay and PCR assays.【Result】 Expression vector withZDSantisense gene was obtained.Resistant bulbs were obtained by retarded selection and transgenic rate was up to 28.54%.The multiplication and differentiation of resistant bulbs were cultured on medium with gradual reduction ofhygconcentration.A total of 65 plants rooted on 1/2 MS+0.2 mg/L NAA+10 mg/L Hyg+100 mg/L Cef,and 12 resistant plantlets were obtained with the transgenic rate of 18.46%.The assays of transgenic plants proved thatgusgene andhyggene were integrated into the genome of 10 transgenic plants and stably expressed,hyggene was expressed butgusgene was not expressed in one transgenic plant,and both genes were not expressed in the other plant.【Conclusion】 Expression vector withZDSantisense gene was constructed and infected into bulb,and 12 transgenic plantlets were obtained.

Narcissustazettavar.Chinensis;ZDSgene;expression vector construction;transformation

時間:2015-08-05 08:57

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.022

2015-03-09

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2007BAD07B00)；福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新團隊基金項目(cxtd12013)

馮 瑩(1984-)，女，安徽金寨人，講師，博士，主要從事園林植物與景觀規(guī)劃研究。E-mail:fengy0919@126.com

潘東明(1956-)，男，福建泉州人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事園藝產(chǎn)品采后科學(xué)研究。 E-mail:pdm666@126.com

S682.2

A

1671-9387(2015)09-0157-08

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