涇渭茯茶化學(xué)成分HPLC指紋圖譜的研究

張 寧，宛曉春，周 杰，張 梁

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

涇渭茯茶化學(xué)成分HPLC指紋圖譜的研究

張 寧，宛曉春，周 杰，張 梁

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

【目的】 采用高效液相色譜法(HPLC)建立涇渭茯茶化學(xué)成分的指紋圖譜，以描述涇渭茯茶化學(xué)成分的整體特性?！痉椒ā?利用HPLC法分析26個(gè)涇渭茯茶樣品的主要化學(xué)成分，通過(guò)化學(xué)對(duì)照品，結(jié)合HPLC-MS多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律，指認(rèn)涇渭茯茶指紋圖譜的主要色譜峰。以乙腈-0.4%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液為梯度洗脫系統(tǒng)，在檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm、柱溫30 ℃、流速1 mL/min條件下，建立涇渭茯茶主要化學(xué)成分的指紋圖譜。采用中藥指紋圖譜相似度軟件，對(duì)涇渭茯茶HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，獲取各樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度?！窘Y(jié)果】 與對(duì)照指紋圖譜相比，26個(gè)不同類型和批次的涇渭茯茶指紋圖譜相似度為0.81～0.94，其中共有峰15個(gè)。經(jīng)過(guò)HPLC-MS分析，主要的共有峰分別鑒定為沒(méi)食子酸、可可堿、沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、普洱茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和槲皮素。【結(jié)論】 26個(gè)批次的涇渭茯茶樣品指紋圖譜相似度較高。

涇渭茯茶；指紋圖譜；化學(xué)成分；茶多酚

涇渭茯茶是我國(guó)陜西省特有的后發(fā)酵黑茶品種[1]。在我國(guó)黑茶的生產(chǎn)和貿(mào)易歷史中，陜西涇陽(yáng)曾經(jīng)是茯磚茶的主要加工地區(qū)。近年來(lái)，隨著對(duì)陜西茯茶特色工藝的傳承和發(fā)揚(yáng)，涇渭茯茶逐漸成為我國(guó)西北地區(qū)的主要黑茶品種。涇渭茯茶的原料選自陜西漢中地區(qū)的茶樹(shù)成熟葉片，經(jīng)過(guò)堆積陳放之后，加工成為磚茶并“發(fā)花”成為涇渭茯茶[2]。由于茯茶的加工過(guò)程與其他發(fā)酵茶葉不同，因此茯茶含有獨(dú)特的化學(xué)成分[3-5]。其他中國(guó)黑茶中也含有一系列特有的化學(xué)成分，這類成分屬于黑茶后發(fā)酵過(guò)程中新生成的化合物[6-7]。此外，黑茶的保健功效也受到人們的廣泛關(guān)注，大量研究報(bào)道了黑茶的降脂降糖活性，使得黑茶成為近年來(lái)茶葉研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[8-10]。

黑茶的化學(xué)成分除了來(lái)自于茶樹(shù)植物的原有化學(xué)成分之外，還有經(jīng)過(guò)后發(fā)酵產(chǎn)生的微生物轉(zhuǎn)化成分[11]。在以往的研究中，綠茶中的兒茶素類成分、紅茶的茶黃素類成分作為茶葉質(zhì)量控制成分備受關(guān)注[12]。但是，由于黑茶發(fā)酵程度的不同，不同產(chǎn)地黑茶的化學(xué)成分差異顯著。涇渭茯茶的發(fā)酵(發(fā)花)過(guò)程比普洱熟茶的渥堆發(fā)酵程度輕，所以其中仍存在高含量的酯型兒茶素[13]。在黑茶化學(xué)成分的研究過(guò)程中，如何能夠突出黑茶特有的化學(xué)成分，同時(shí)兼顧茶樹(shù)植物的原有成分是一個(gè)值得思考的問(wèn)題。指紋圖譜主要應(yīng)用于中藥生產(chǎn)加工過(guò)程中的質(zhì)量控制[14-15]。黑茶中的指紋圖譜是一種以多成分色譜保留性質(zhì)為參數(shù)，建立復(fù)雜茶葉化學(xué)成分色譜峰屬性的分析方法。為了能夠描述涇渭茯茶化學(xué)成分的整體特性，本研究通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)建立涇渭茯茶化學(xué)成分的指紋圖譜，以茶葉中主要的化學(xué)成分為對(duì)照，鑒定了其中主要的指紋色譜峰。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究收集的涇渭茯茶樣本由陜西蒼山茶葉有限公司提供，共包括4個(gè)系列，26個(gè)不同等級(jí)的樣品(表1)。樣品經(jīng)過(guò)55 ℃烘干后，采用手持式粉碎機(jī)粉碎，樣品粉碎后過(guò)0.175 mm篩，并置于4 ℃冰箱內(nèi)密封保存。

表1 涇渭茯茶樣品的信息Table 1 Details of Jingwei fu tea samples

1.2 儀器與試劑

主要儀器包括Waters 高效液相色譜儀(配有Waters 1525 Binary HPLC 泵、Waters 2707 自動(dòng)進(jìn)器)，Waters 2489 UV/Visible 檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；色譜柱Agilent SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，并且配Phenomenex保護(hù)柱；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AB104-N 電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。主要試劑有乙腈(色譜純)和甲酸(分析純)。

1.3 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取4份100 mg粉碎茶樣置于4 mL離心管中，分別加入1 mL乙酸乙酯、體積分?jǐn)?shù)62.5%的甲醇[16]、甲醇和體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇超聲提取30 min，取上清液3 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，待HPLC分析。

1.4 HPLC條件

色譜條件：流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.4%的甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫條件：0～5 min 5%～12% B；5～30 min 12% B；30～40 min 12%～16% B；40～50 min 16% B；50～60 min 16%～22% B；60～75 min 22%～29% B；75～90 min 29%～50% B；90～95 min 50% B。檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL。梯度洗脫中百分含量均為體積分?jǐn)?shù)。

1.5 HPLC-MS分析

采用安捷倫G6300系列HPLC-MS系統(tǒng)、二極管陣列檢測(cè)器、LC/MSD離子阱、Xcalibur色譜工作站。液相色譜條件與1.4中色譜條件相同。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；源電壓3.5 kV，毛細(xì)管溫度325 ℃，毛細(xì)管電壓35 V，殼氣壓172.375 kPa，輔助氣壓82.74 kPa；采用全離子掃描方式，掃描范圍(質(zhì)荷比，m/z)100～2 000。以標(biāo)準(zhǔn)化合物對(duì)照品作為參照，鑒定共有色譜峰的結(jié)構(gòu)。對(duì)于缺少對(duì)照品的色譜峰，通過(guò)正離子/負(fù)離子模式確定色譜峰的分子量。以準(zhǔn)分子離子峰為母離子，采用碰撞誘導(dǎo)解離裂解選定母離子，并且對(duì)碎片離子峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，推導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)。

1.6 HPLC指紋圖譜分析

用中藥指紋圖譜相似度軟件導(dǎo)入涇渭茯茶HPLC圖譜AIA原始文件，獲取26個(gè)批次涇渭茯茶HPLC的共有色譜峰，并且建立對(duì)照指紋圖譜。以蘆丁(保留時(shí)間=41.4 min)色譜峰為參照峰，計(jì)算其他共有色譜峰與參照峰的相對(duì)峰面積。計(jì)算共有色譜峰相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，作為評(píng)價(jià)涇渭茯茶HPLC指紋圖譜相似度的重要依據(jù)。用指紋圖譜相似度軟件，計(jì)算26個(gè)批次涇渭茯茶HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的整體相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 涇渭茯茶提取方法的優(yōu)化

參照已有的黃酮類物質(zhì)提取方法，比較不同溶劑對(duì)于涇渭茯茶化學(xué)成分的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用體積分?jǐn)?shù)62.5%的甲醇提取之后，樣品的HPLC色譜峰響應(yīng)強(qiáng)度高，峰數(shù)量多。基于已有文獻(xiàn)報(bào)道[16]，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，最終確定涇渭茯茶的提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)62.5%的甲醇。

2.2 涇渭茯茶指紋圖譜的建立

對(duì)26個(gè)不同批次茶葉樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)后，用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行計(jì)算，得到S1～S26共26個(gè)涇渭茯茶樣本的指紋圖譜(圖1)。圖1-A為中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件生成的對(duì)照指紋圖譜，指紋圖譜相似度軟件辨識(shí)出26個(gè)批次涇渭茯茶中的15個(gè)共有峰。

2.3 涇渭茯茶共有指紋峰的HPLC-MS鑒定

以9號(hào)峰的色譜峰作為參比峰，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積。以色譜峰相對(duì)峰面積作為參數(shù)，15個(gè)主要色譜峰相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表2所示。以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和質(zhì)譜信號(hào)作為對(duì)照，其中9個(gè)共有峰分別被鑒定為沒(méi)食子酸、可可堿、沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、普洱茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和槲皮素。此外，以HPLC-MS質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)解離(CID)信號(hào)為依據(jù)，還推導(dǎo)出其他2個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。

以其中8號(hào)和9號(hào)色譜峰為代表，通過(guò)HPLC-MS質(zhì)譜CID信號(hào)推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)的過(guò)程，結(jié)果如圖2所示。

8號(hào)峰的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z731.1，[M-H]-m/z729.0，其相對(duì)分子質(zhì)量為730。以[M-H]-m/z729.0為母離子，通過(guò)CID信號(hào)獲得其二級(jí)碎片離子m/z603.0(-126/原花青素A環(huán)片段)，m/z577.0 (-152/-gallic acid+H2O)，m/z559.0 (-170/-gallic acid)，m/z440.9 (catechin gallate-H)和m/z288.9 (catechin-H)。推斷其標(biāo)志性離子m/z440.9為兒茶素沒(méi)食子酸酯的準(zhǔn)分子離子峰。通過(guò)對(duì)m/z440.9進(jìn)行CID信號(hào)分析，發(fā)現(xiàn)其主要的三級(jí)碎片離子峰為m/z288.9(-152/-gallic acid+H2O)。通過(guò)對(duì)碎片離子的分析，可以推導(dǎo)8號(hào)峰化合物含有2×黃烷醇母核、1×沒(méi)食子酸基團(tuán)，推導(dǎo)其可能的結(jié)構(gòu)如圖2所示。

9號(hào)峰的準(zhǔn)分子離子峰為[M+Na]+m/z795.2，[M-H]-m/z771.1，其相對(duì)分子質(zhì)量為772。以[M-H]-m/z771.1為母離子，通過(guò)分析CID信號(hào)獲得其二級(jí)碎片離子m/z609.0 (-162/-glucose+H2O)，m/z462.9 (-162-146/-glucose-rahmnose+2H2O)，m/z300.8 (-162-146-162/-glucose-rahmnose-glucose+3H2O)。通過(guò)對(duì)碎片離子的分析，可以推導(dǎo)9號(hào)峰化合物含有黃酮苷元母核(槲皮素)、2×葡萄糖基團(tuán)和1×鼠李糖基團(tuán)，推導(dǎo)其可能的結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖1 26涇渭茯茶樣品的HPLC指紋圖譜A.對(duì)照；B.S1～S26

表2 涇渭茯茶15個(gè)共有峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定Table 2 Identification of shared HPLC peaks of Jingwei fu tea samples

續(xù)表2 Continued table 2

注：*“+”表示有，“-”表示無(wú)。

Note:“+” means exist,“-” means no exist.

圖2 涇渭茯茶指紋圖譜中8號(hào)和9號(hào)色譜峰的質(zhì)譜裂解碎片解析

2.4 涇渭茯茶指紋圖譜的相似度

通過(guò)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，分別將26個(gè)涇渭茯茶HPLC色譜圖與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，涇渭茯茶樣本的指紋圖譜相似度為0.81～0.94。從指紋圖譜(圖1)中可以看出,各個(gè)系列的涇渭茯茶樣品都具有相同的主成分峰, 但是峰面積比值不盡相同。結(jié)果提示不同年份、不同等級(jí)和不同工藝的茶葉樣本，主要成分的含量存在一定差異。

表3 涇渭茯茶HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度Table 3 Similarities of HPLC fingerprints of Jingwei fu tea samples with reference fingerprints

3 討 論

通過(guò)對(duì)樣品提取方法的優(yōu)化，使涇渭茯茶主要化學(xué)成分的色譜分離度達(dá)到了指紋圖譜的基本要求。為了能夠盡可能多地獲得涇渭茯茶中化學(xué)成分的HPLC-UV信號(hào)，前人比較了280與320 nm波長(zhǎng)的檢測(cè)效果，雖然280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下主要的多酚(兒茶素)成分能夠得到較好的響應(yīng)，但是其他含量較低的黃酮類化合物信號(hào)較差[17]，故本研究最終選擇320 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。本研究收集的涇渭茯茶樣本屬于不同年份、不同等級(jí)和不同工藝的樣本，所以不同樣本之間主要成分的含量存在一定差異。對(duì)涇渭茯茶指紋圖譜進(jìn)行分析共獲得了相關(guān)的15個(gè)共有色譜峰，這些色譜峰不僅包括了茶葉原料中高含量的酯型兒茶素，還有黃酮和黃酮苷以及黑茶后發(fā)酵過(guò)程中特有的兒茶素微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，系統(tǒng)而全面地反映了涇渭茯茶化學(xué)成分的特點(diǎn)。

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HPLC fingerprints of chemical constituents of Jingwei fu tea

ZHANG Ning,WAN Xiao-chun,ZHOU Jie,ZHANG Liang

(KeyLaboratoryofTeaBiochemistryandBiotechnology,MinistryofEducation,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 This study investigated the fingerprint of Jingwei fu tea using high performance liquid chromatography (HPLC).【Method】 With the gradient elution of HPLC,the main chemical constituents of Jingwei fu tea were analyzed and identified by reference chemicals and HPLC-MS.The gradient elution phase containing acetonitrile and 0.4% formic acid were used to separate the main chemical constituents of Jingwei fu tea at the wavelength of 320 nm,temperature of 30 ℃ and elution ratio of 1 mL/min.The HPLC fingerprints of 26 Jingwei fu tea samples were analyzed by Traditional Chinese medicine (TCM) fingerprint similarity calculation software.【Result】 The similarities of 26 samples with different types and batches were in the range of 0.81-0.94 compared with the control HPLC fingerprint generated by TCM fingerprint similarity calculation software.Fifteen shared peaks of HPLC fingerprints were analyzed by HPLC-MS.Nine of these peaks were identified as gallic acid,theobromine,gallocatechin,epigallocatechin,catechin,epicatechin,puerins,epicatechin gallate and quercetin.【Conclusion】 The fingerprints of 26 Jingwei fu tea samples were highly similar.

Jingwei fu tea;fingerprint;chemical constituents;tea polyphenols

時(shí)間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.015

2014-02-21

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31201335)；安徽省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(1308085QC51)

張 寧(1989-)，女，山東泰安人，在讀碩士，主要從事茶葉化學(xué)成分及功效研究。E-mail：zning7@163.com

張 梁(1985-)，男，江西彭澤人，副教授，主要從事茶葉化學(xué)成分及功效研究。E-mail：zhli2091@sina.com

S571.1;TS201.2

A

1671-9387(2015)09-0103-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.030.html