茂源鏈霉菌原生質(zhì)體的制備與再生

趙文超，牛延寧，金明飛，黃 靜，高紅亮，常忠義，方 瑩，魯 偉，步建國

(1 華東師范大學 生命科學學院，上海 200241；2 泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411)

茂源鏈霉菌原生質(zhì)體的制備與再生

趙文超1，牛延寧1，金明飛1，黃 靜1，高紅亮1，常忠義1，方 瑩1，魯 偉2，步建國2

(1 華東師范大學 生命科學學院，上海 200241；2 泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411)

【目的】 探索制備高純度茂源鏈霉菌原生質(zhì)懸液的條件，為原生質(zhì)體融合提供支持。【方法】 在茂源鏈霉菌菌絲體一級培養(yǎng)不同時間(4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48 h)后，稱取菌絲體干質(zhì)量，確定一級培養(yǎng)最佳時間；將一級培養(yǎng)的菌絲體轉(zhuǎn)接培養(yǎng)二級菌絲體，在不同培養(yǎng)時間(13，14.5，16，17.5，19，20.5 h)根據(jù)原生質(zhì)體制備率、再生率的綜合情況及菌絲體形態(tài)顯微鏡觀察結(jié)果，確定二級菌絲體的培養(yǎng)時間及培養(yǎng)基中添加甘氨酸的最佳質(zhì)量濃度(0，2，5，10，20 g/L)，根據(jù)原生質(zhì)體制備率和再生率確定使用溶菌酶的質(zhì)量濃度(2,5,8,10,20,50 mg/mL)和酶解時間(1,2,3,4,5,6,7,8 h)，使用不同方法(500 r/min離心法與雙層18 μm和0.45 μm濾膜過濾法)分離原生質(zhì)體，對原生質(zhì)體分離后的損耗情況進行比較，確定分離條件?！窘Y(jié)果】 茂源鏈霉菌一級菌絲體的最佳培養(yǎng)時間為28 h；二級菌絲體培養(yǎng)的最佳條件為：在培養(yǎng)基中添加5 g/L甘氨酸，培養(yǎng)16 h,溶菌酶最適質(zhì)量濃度為8 mg/mL，酶解 3～4 h；以500 r/min離心分離原生質(zhì)體可以獲得較純凈的原生質(zhì)體懸液；茂源鏈霉菌原生質(zhì)體制備率最高達97.82%，再生率最高達9.04%，純度最高達87.53%。 【結(jié)論】 得到了制備高純度的茂源鏈霉菌原生質(zhì)體懸液的條件。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶；茂源鏈霉菌；原生質(zhì)體

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase，TG，EC2.3.2.13)在食品工業(yè)、藥品工業(yè)中的使用越來越廣泛[1]，TG酶可催化蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與氨基酸之間的交聯(lián)，也可水解蛋白質(zhì)分子中的谷氨酰胺殘基；改造的蛋白質(zhì)可提高產(chǎn)品的發(fā)泡性、乳化性及其乳化穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和凝膠能力[1]。TG酶廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)[2]，現(xiàn)階段商業(yè)化的TG酶主要是通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)的[3]。茂源鏈霉菌(Streptoverticilliummobaraensis)是生產(chǎn)TG酶的常用菌種之一，TG酶以酶原(pro-TGase)的形式被分泌到胞外，并在鏈霉菌自身分泌的蛋白酶作用下切除前肽(pro-region)成為有活性的酶。菌株的優(yōu)化對TG酶產(chǎn)量及酶活性的提高有著極其重要的作用。20世紀80年代，前蘇聯(lián)等國的科學家提出了一個關(guān)于鏈霉菌的新型菌種馴化方法[4]：基因組重排法(Genome Shuffling)。隨著細胞生物學水平和微生物育種學水平的進步，基因組重排技術(shù)不斷改進，其在工業(yè)微生物育種學中的應(yīng)用也越來越廣泛[5]。在基因組重排技術(shù)中，原生質(zhì)體融合是關(guān)鍵步驟之一，而在原生質(zhì)體融合過程中，原生質(zhì)體的制備尤為重要[6]。20世紀90年代初，日本味之素公司成功地將TG酶制品推廣至市場[7]。近些年，國內(nèi)外學者對于TG酶的研究一直在不斷推進之中，產(chǎn)TG酶的菌種也在不斷改良，但是所用菌種大都為自然選育和誘變育種，菌種選育效率不高，工作量大，產(chǎn)量增幅有限。國內(nèi)對TG的研究和利用與國際先進水平相比，仍然存在很大差距[8-10]。

本研究對茂源鏈霉菌原生質(zhì)體制備至提純的步驟進行了探討與優(yōu)化，得到了數(shù)量足、純度高的原生質(zhì)體懸液，以期為后續(xù)的茂源鏈霉菌原生質(zhì)體融合及基因組重排技術(shù)研究提供優(yōu)質(zhì)的融合體。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 茂源鏈霉菌(Streptoverticilliummobaraensis)[11]，由華東師范大學微生物學實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基： 高氏一號培養(yǎng)基[12]121 ℃滅菌20 min。

菌絲體培養(yǎng)基：甘油 20 g，酵母膏 5 g，蛋白胨 25 g，MgSO4·7H2O 2 g,K2HPO4·3H2O 2 g，pH 7.4,水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

再生培養(yǎng)基：甘油 20 g，酵母膏 5 g，魚粉蛋白胨 25 g，胰蛋白胨 2 g，酶水解干酪素 1 g，MgSO4·7H2O 2 g,K2HPO4·3H2O 2 g，蔗糖 103.6 g，pH 7.4,水1 000 mL，115 ℃滅菌15 min。

STC溶液：由4種溶液混合而成。其中， ①蔗糖103.6 g，K2SO40.25 g，MgCl2·6H2O 2.02 g，定容至880 mL，115 ℃滅菌15 min；②KH2PO40.05 g，定容至10 mL,121 ℃滅菌20 min；③CaCl2·2H2O 1.84 g，定容至10 mL，121 ℃滅菌20 min；④Tris 1.211 g，EDTA 0.372 g，SDS 0.028 8 g，定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min。①∶②∶③∶④按照88∶1∶1∶10的體積比混合使用[13-14]。

1.1.3 主要試劑 甘氨酸、Tris、EDTA、SDS為生工公司進口分裝，胰蛋白胨為英國OXIOD公司產(chǎn)品，溶菌酶為Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 孢子培養(yǎng) 取200 μL體積分數(shù)40%甘油保種的茂源鏈霉菌菌種，于一新鮮高氏一號培養(yǎng)基上斜面活化，28 ℃培養(yǎng)7 d(第1代)后，用1 mL無菌水洗下斜面孢子，取200 μL再次轉(zhuǎn)接至高氏一號培養(yǎng)基斜面上，28 ℃培養(yǎng)7 d(第2代)。同法再次菌種傳代(第3代)，將此菌種作為制備原生質(zhì)體的出發(fā)菌株。

1.2.2 菌絲體培養(yǎng) 出發(fā)菌株用1 mL無菌水洗下，制成孢子懸液，混勻后取500 μL接種到裝有5 mL菌絲體培養(yǎng)基的長試管(20 mm×200 mm)中，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)一定時間(4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48 h，一級培養(yǎng))后,將菌絲體過濾烘干至恒質(zhì)量。而后將一級培養(yǎng)的菌絲體轉(zhuǎn)接至一新鮮菌絲體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min下再培養(yǎng)一定時間(13，14.5，16，17.5，19，20.5 h，二級培養(yǎng))，培養(yǎng)后的二級菌絲體用相差顯微鏡進行觀察。確定培養(yǎng)最佳時間后，在培養(yǎng)基中分別添加0，2，5，10，20 g/L的甘氨酸。將最佳時間下添加最適甘氨酸后培養(yǎng)所得菌絲體作為制備原生質(zhì)體的材料菌株。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備 將材料菌株懸液以4 000 r/min離心分離菌體，沉淀用一定質(zhì)量濃度(2,5,8,10,20,50 mg/mL)的溶菌酶溶液復(fù)溶，于37 ℃水浴中溫育反應(yīng)，根據(jù)酶解情況分別在不同反應(yīng)時間(1,2,3,4,5,6,7,8 h)終止反應(yīng)。差速離心法(500 r/min)分離原生質(zhì)體與未破壁菌體的混合液，得到較純凈的原生質(zhì)體懸液。

1.2.4 原生質(zhì)體懸液的分離 對制備的原生質(zhì)體懸液進行分離。原生質(zhì)體懸液分別用不分離、離心法(500 r/min)和過濾法(雙層18 μm和0.45 μm濾膜) 分離，比較3種方法得到的原生質(zhì)體數(shù)量和純度及損耗率。

1.2.5 原生質(zhì)體的再生 原生質(zhì)體懸液按梯度稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基平板上，使原生質(zhì)體再生，于30 ℃培養(yǎng)4 d。

在分離得到的原生質(zhì)體懸液中加入9倍無菌水，于搖床上30 ℃、60 r/min溫育30 min以上，為原生質(zhì)體水處理。而后按梯度10-1，10-2，10-3，10-4稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)4 d。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0軟件分析。

原生質(zhì)體再生率、制備率和純度計算公式如下：

再生率=(A-B)/(C-D)×100%。

制備率=1-B/(C-D)×100%。

純度=(A-B)/A×100%。

式中：A為原生質(zhì)體再生數(shù)量，從再生培養(yǎng)基上計數(shù)獲得；B為原生質(zhì)體水處理后生長的菌體數(shù)，從原生質(zhì)體水處理后的再生平板上獲得；C為制備前原液中

的菌絲體總數(shù)，菌絲體培養(yǎng)后涂板計數(shù)獲得；D為原生質(zhì)體與菌絲體混合液水處理生長的菌體數(shù)，菌絲體水處理后涂板計數(shù)獲得[13]。

損耗率為分離后獲得的原生質(zhì)體數(shù)量與未分離出的原生質(zhì)體數(shù)量的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 茂源鏈霉菌菌絲體的培養(yǎng)

2.1.1 一級菌絲體的培養(yǎng) 如圖1所示，茂源鏈霉菌一級菌絲體的培養(yǎng)效果與菌絲體的生長狀態(tài)相關(guān)，菌絲體干質(zhì)量于28 h進入對數(shù)生長末期，具有最佳的菌種活力，能夠為二級菌絲體培養(yǎng)提供活力強且穩(wěn)定的菌種。

圖1 茂源鏈霉菌一級菌絲體的生長曲線

2.1.2 二級菌絲體的培養(yǎng) 二級菌絲體的培養(yǎng)效果決定了原生質(zhì)體的制備率與再生率。如圖2所示，從制備率與再生率情況看，培養(yǎng)16 h時，原生質(zhì)體的制備效果最佳。在相差顯微鏡下觀察菌絲體的情況，發(fā)現(xiàn)16 h時菌絲體尚未形成大的菌絲球，分散狀態(tài)的菌絲較多；而16 h后其菌絲體明顯增大，不利于溶菌酶作用(圖3)。

圖2 茂源鏈霉菌二級菌絲體的培養(yǎng)效果

圖3 不同培養(yǎng)時間下茂源鏈霉菌二級菌絲體的相差顯微鏡觀察結(jié)果(×400)
Fig.3 Comparison ofStreptoverticilliummobaraensismycelium(level 2)after different incubation times under phase microscope (×400)

2.1.3 添加甘氨酸對原生質(zhì)體制備的影響 在菌絲體培養(yǎng)基中加入甘氨酸有利于溶菌酶溶解細胞壁，表1顯示，當甘氨酸添加量為5 g/L時，原生質(zhì)體的制備和再生情況最佳，對原生質(zhì)體制備最有利。

表1 添加甘氨酸對茂源鏈霉菌原生質(zhì)體制備的影響Table 1 Effect of Gly on preparation of Streptoverticillium mobaraensis protoplast %

2.2 茂源鏈霉菌原生質(zhì)體制備的酶解條件

溶菌酶對原生質(zhì)體制備的影響主要由溶菌酶質(zhì)量濃度和酶解時間決定。茂源鏈霉菌原生質(zhì)體制備的酶解條件見表2。

表2 溶菌酶質(zhì)量濃度對茂源鏈霉菌原生質(zhì)體制備的影響(3 h)Table 2 Effect of lysozyme concentration on protoplast preparation of Streptoverticillium mobaraensis mycelium %

由表2可見，溶菌酶質(zhì)量濃度直接影響原生質(zhì)體的制備率和再生率，當酶解時間為3 h，溶菌酶的質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，原生質(zhì)體的制備率與再生率的乘積最大，說明此時在等量菌絲體的情況下，原生質(zhì)體再生出的菌落數(shù)達到最多，原生質(zhì)體的制備效果最佳。

由圖4可見，隨著酶解時間的延長，茂源鏈霉菌原生質(zhì)體的制備率上升，而再生率下降，兩者的乘積在3～4 h處達到極值，故3～4 h是溶菌酶酶解的最佳時間。

圖4 酶解時間對茂源鏈霉菌原生質(zhì)體制備的影響
Fig.4 Effect of enzymolysis time on protoplast preparation ofStreptoverticilliummobaraensismycelium

2.3 茂源鏈霉菌原生質(zhì)體懸液分離方法的篩選

如表3所示，用離心法分離對茂源鏈霉菌原生質(zhì)體的損耗較少,純度較高，而過濾法造成了部分原生質(zhì)體的損失，再生率降低，獲得原生質(zhì)體再生菌落的數(shù)量減少;對比原生質(zhì)體損耗和原生質(zhì)體懸液的綜合情況，認為使用離心法可以獲得純度更高的原生質(zhì)體懸液。

表3 茂源鏈霉菌原生質(zhì)體懸液分離方法的篩選Table 3 Effect of separation method on protoplast loss and purity of Streptoverticillium mobaraensis mycelium %

3 討 論

有關(guān)微生物原生質(zhì)體的制備已有很多文獻報道，方法較成熟，但是由于不同菌種的生長情況和菌體結(jié)構(gòu)有很大不同，故報道的經(jīng)典原生質(zhì)體制備方法并不可直接用于茂源鏈霉菌的原生質(zhì)體制備，需要進行改良。在原生質(zhì)體的制備過程中，菌絲體制備、酶解過程和原生質(zhì)體的分離是關(guān)鍵步驟[13]。菌絲體的制備使用一級、二級菌絲體培養(yǎng)，可以避免高氏一號培養(yǎng)基斜面上孢子數(shù)量和狀態(tài)對菌絲體培養(yǎng)的影響，從而實現(xiàn)菌體生長的同步化。本研究發(fā)現(xiàn)，直接使用一級菌絲體制備原生質(zhì)體時，菌株材料培養(yǎng)后生長情況不穩(wěn)定，制備效果重復(fù)性差。而一級菌絲體可為二級菌絲體提供生長狀態(tài)良好的接種菌株，二級菌絲體與溶菌酶的接觸和作用要求菌絲球體積小、松散[14]。茂源鏈霉菌是革蘭氏陽性菌，甘氨酸對其細胞壁的正常形成有干擾作用，因此將細胞壁肽聚糖中的丙氨酸替換為甘氨酸，會更易與溶解酶作用，有利于細胞壁的酶解[15]。加入的甘氨酸量必須適中[15]，過少則不起作用，過多則影響菌絲體生長，本試驗結(jié)果證明，添加5 g/L甘氨酸最適合茂源鏈霉菌的原生質(zhì)體再生。菌種對溶菌酶都有一定的耐受力，溶菌酶質(zhì)量濃度過低或酶解時間過短，都制備不出原生質(zhì)體[16]；質(zhì)量濃度過高或酶解時間過長，對原生質(zhì)體有害，不利于原生質(zhì)體的再生，本試驗中用8 mg/mL溶菌酶作用3～4 h時，茂源鏈霉菌原生質(zhì)體的制備效果最佳。受菌種自身情況的制約，制備的原生質(zhì)體懸液中包含未破壁的菌絲體成分，其對后期的原生質(zhì)體融合和篩選有巨大的影響，而用離心法分離原生質(zhì)體懸液，可以除去大部分未破壁菌體和雜質(zhì)，排除再生平板上的假陽性干擾，并可保證分離過程中原生質(zhì)體受損不大，對獲得高純度原生質(zhì)體懸液有利。

本試驗中,在甘氨酸添加量5 g/L、500 r/min離心分離的條件下，茂源鏈霉菌原生質(zhì)體制備率達到97.82%，再生率達到9.04%，相比其他優(yōu)化研究結(jié)果[16]，本研究結(jié)果均較好。本研究得到的高純度原生質(zhì)體懸液，為后續(xù)的原生質(zhì)體融合及高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶茂源鏈霉菌菌株的篩選提供了可能。

[1] Yokoyama K,Utsumi H,Nakamura T,et al.Screening for improved activity of a transglutaminase fromStreptomycesmobaraensiscreated by a novel rational mutagenesis and random mutagenesis [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2010,87(6):2087-2096.

[2] 王 莉，常忠義，李平作.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因在大腸桿菌中的克隆表達 [J].中國生物工程雜志,2004,24(11):56-60.

Wang L,Chang Z Y,Li P Z.Cloning and expression of transglutaminase gene inEscherichiacoli[J].China Biotechnology,2004,24(11):56-60.(in Chinese)

[3] Motoki M,Kumazawa Y.Recent research trends in transglutaminase technology for food processing [J].Food Science and Technology Research,2000,6(3):151-160.

[4] 崔基風，顧覺奮.蘇聯(lián)鏈霉菌原生質(zhì)體融合研究概況 [J].國外醫(yī)藥:抗生素分冊,1993,14(5):321-325.

Cui J F,Gu J F.The soviet union research ofStreptomycesprotoplastfusion [J].World Notes on Antibiotics,1993,14(5):321-325.(in Chinese)

[5] Zhang Y,Perry K,Vinci V A,et al.Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria [J].Nature,2002,415(6872):644-646.

[6] 秦芳芳，龔雪萍，趙文超,等.基因組重排技術(shù)在鏈霉菌育種應(yīng)用中的研究進展 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012,40(34):16529-16530.

Qin F F,Gong X P,Zhao W C,et al.Recent advances of genome shuffling in the application ofStreptomycesbreeding [J].Journal of Anhui Agri Sci,2012,40(34):16529-16530.(in Chinese)

[7] 王 璋，王灼維，莫湘筠.微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶生產(chǎn)菌株的育種研究 [J].中國生物工程雜志,2003,23(6):1-5.

Wang Z,Wang Z W,Mo X J.New advances of screening and breeding efficient microbial strains producing transglutaminase [J].China Biotechnology,2003,23(6):1-5.(in Chinese)

[8] Motoki M,Nio N,Takinami K.Functional properties of food proteins polymerized by transglutaminase [J].Agricultural and Biological Chemistry,1984,48(5):1257-1261.

[9] 田沛霖，朱一辰，金明飛，等.高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶茂原鏈霉菌的快速篩選 [J].西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版，2013,41(3):187-192.

Tian P L,Zhu Y C,Jin M F,et al.Rapid screening for high-yield MTG-producing strains ofStreptoverticilliummobaraensis[J].Journal of Northwest A&F University：Nat Sci Ed,2013,41(3):187-192.(in Chinese)

[10] 劉 穎，田沛霖，陳 佳，等.產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶菌株的高通量篩選 [J].西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版,2013,41(6):167-172.

Liu Y,Tian P L,Chen J,et al.Novel high-throughput screening ofStreptoverticilliummobaraensiswith high microbial transglutaminase yield [J].Journal of Northwest A&F University:Nat Sci Ed,2013,41(6):167-172.(in Chinese)

[11] 陳 佳，金明飛，譚玉靜,等.NaCl 對輪枝鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的促進作用研究 [J].中國生物工程雜志,2013,33(2):54-58.

Chen J,Jin M F,Tan Y J,et al.Enhancement of transglutaminase production inStreptoverticilliummobaraensisas achieved by treatment with NaCl [J].China Biotechnology,2013,33(2):54-58.(in Chinese)

[12] 常忠義，楊雪霞，莊曉輝,等.氮源水解液對鏈霉菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶合成的影響 [J].華東師范大學學報:自然科學版,2005(Z1):183-187.

Chang Z Y,Yang X X,Zhuang X H,et al.Effects of the hydrolysate of nitrogen sources on transglutaminase byStreptomyces[J].Journal of East China Normal University:Natural Science,2005(Z1):183-187.(in Chinese)

[13] Xu B,Jin Z,Wang H,et al.Evolution ofStreptomycespristinaespiralisfor resistance and production of pristinamycin by genome shuffling [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2008,80(2):261-267.

[14] 于秀蓮，張怡軒，石 喬，等.吸水鏈霉菌井岡變種原生質(zhì)體的制備與再生 [J].沈陽藥科大學學報，2007,24(5):315-319.

Yu X L,Zhang Y X,Shi Q,et al.Protoplasts preparation and regeneration ofStreptomyceshygrascopicusvar．JinggangensisYen [J].Journal of Shenyang Pharmaceutical University,2007,24(5):315-319.(in Chinese)

[15] Baltz R H,Matsushima P.Protoplast fusion inStreptomyces:Conditions for efficient genetic recombination and cell regeneration [J].Journal of General Microbiology,1981,127(1):137-146.

[16] 包瑩玲,潘 力.茂源鏈霉菌原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化 [J].現(xiàn)代食品科技,2008(2):138-142.

Bao Y L,Pan L.Optimization of protoplast preparation from spores ofStreptoverticilluimmobaraense[J].Modern Food Science and Technology,2008(2):138-142.(in Chinese)

Preparation and regeneration of protoplast fromStreptoverticilliummobaraensis

ZHAO Wen-chao1,NIU Yan-ning1,JIN Ming-fei1,HUANG Jing1,GAO Hong-liang1,CHANG Zhong-yi1,FANG Ying1,LU Wei2,BU Jian-guo2

(1CollegeofLifeSciences,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China;2TaixingDongshengFoodScience&Technology,Taixing,Jiangsu225411,China)

【Objective】 The optimal preparation conditions of protoplast ofStreptoverticilliummobaraensiswere studied to provide information for fusion of protoplast.【Method】 After being cultured for different times (4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,and 48 h),the optimal time for primary culturing was determined by weighing the dry mass of mycelium.Then the optimal secondary culturing time and concentration of glycine in medium were determined by culturing the mycelium for different times (13,14.5,16,17.5,19 and 20.5 h) and different glycine concentrations (0,2,5,10 and 20 g/L) as well as considering the preparation ratio,regeneration ratio,and morphology.The concentrations of protoplast suspension (2,5,8,10,20 and 50 mg/mL),the hydrolysis times (1,2,3,4,5,6,7 and 8 h) and different separation methods (500 r/min centrifugation and 18 μm and 0.45 μm membrane filtration) were also tested and compared to determine optimal conditions.【Result】 The culture time of primary strain body was 28 h.The optimal culturing conditions for secondary mycelium were:5 g/L glycine,culture time 16 h,lysozyme concentration 8 mg/mL,enzyme degradation time 3-4 h,and using 500 r/min centrifugation.With the optimal conditions,the preparation ratio,regeneration ratio and purity of protoplast were 97.82%,9.04%,and 87.53%,respectively.【Conclusion】 The optimal conditions for preparation of protoplast with high purity fromStreptoverticilliummobaraensiswere obtained.

transglutaminase;Streptoverticilliummobaraensis;protoplast

時間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.028

2014-02-28

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(201310255)

趙文超(1988-)，男，江蘇丹陽人，在讀碩士，主要從事應(yīng)用微生物學研究。E-mail：zhaowenchao1031@163.com

金明飛(1979-)，男，浙江桐鄉(xiāng)人，助理研究員，博士，主要從事應(yīng)用微生物學研究。E-mail：mfjin@bio.ecnu.edu.cn

Q935

A

1671-9387(2015)11-0187-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.056.html