豬流行性腹瀉病毒3種抗原卵黃抗體的制備

胡青松,李呂木，張小飛，許發(fā)芝，丁小玲，徐延偉，丁維民

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036；2 南京天邦生物科技有限公司，江蘇 南京 211102；3 安徽安泰農(nóng)業(yè)集團，安徽 廣德 242200)

豬流行性腹瀉病毒3種抗原卵黃抗體的制備

胡青松1,李呂木1，張小飛2，許發(fā)芝1，丁小玲1，徐延偉2，丁維民3

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036；2 南京天邦生物科技有限公司，江蘇 南京 211102；3 安徽安泰農(nóng)業(yè)集團，安徽 廣德 242200)

【目的】 探討豬流行性腹瀉病毒(PEDV)3種不同抗原制備的卵黃抗體對PEDV的中和能力，為抗豬流行性腹瀉卵黃抗體的制備提供新的方法和理論基礎?！痉椒ā?根據(jù)PEDV S糖蛋白基因設計引物擴增PEDVS534基因(636～789位氨基酸)和PEDVCOE基因(499～638位氨基酸)，并構建原核表達質(zhì)粒pET32a-PEDV S534和pET32a-COE，分別轉(zhuǎn)化表達菌株BL21(DE3)進行誘導表達。以原核表達的PEDV S534蛋白、COE蛋白以及PEDV滅活病毒為抗原，分別免疫產(chǎn)蛋雞并制備卵黃抗體，通過病毒中和試驗評價各卵黃抗體的中和效力?！窘Y果】 成功表達了PEDV S534蛋白和COE蛋白，Western-Blotting分析顯示，2種蛋白均具有很好的免疫原性；制備的3種特異性卵黃抗體均具有一定的病毒中和能力，PEDV S534蛋白特異性卵黃抗體的中和效價為1∶12，COE蛋白特異性卵黃抗體的中和效價為1∶25，而PEDV滅活病毒的卵黃抗體中和效價達到1∶120?！窘Y論】 PEDV滅活病毒的中和能力最強，其次為COE蛋白特異性卵黃抗體， PEDV S534卵黃抗體的中和能力較弱。

豬流行性腹瀉病毒；原核表達；卵黃抗體；中和試驗

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種以嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床特征的高度接觸性傳染病[1]，是引起當今世界各國仔豬早期死亡的重要疫病之一[2]。目前主要使用疫苗免疫妊娠母豬，通過母源抗體保護仔豬來防治仔豬PED。然而，由于母源抗體存在時間短，不能使仔豬安全渡過整個生長階段。此外，也有通過在飼料中大量添加抗生素來治療PED，但抗生素對病毒性腹瀉無效，只能起到防止繼發(fā)感染的效果，且抗生素的殘留也容易引起食品安全等問題。因此，研制開發(fā)安全有效的環(huán)保型生物制劑成為防治PED的重要課題。為此，在控制PED方面，特異性的卵黃抗體(Egg yolk antibody，IgY)以其效果明確、制備簡單、安全性好等優(yōu)勢越來越受到人們的重視。

目前已經(jīng)研發(fā)出以PEDV全病毒作為免疫原制備的卵黃抗體[3-6]，但以含PEDV中和表位的重組蛋白為免疫原制備卵黃抗體的研究尚未見報道。而以抗原表位蛋白作為免疫原制備卵黃抗體則更為可行和有效，如Sotiropoulou等[7]利用重組的KLK6蛋白免疫蛋雞制備的特異性卵黃抗體在臨床樣品診斷方面深受歡迎；Han等[8]用原核表達的犬細小病毒VP2蛋白制備的卵黃抗體和劉文鑫等[9]以大腸桿菌菌毛蛋白K88ab和K99制備的卵黃抗體均具有顯著的治療效果；江馗語[10]采用基因工程技術表達豬瘟病毒不同的抗原表位蛋白，免疫產(chǎn)蛋雞后制備的卵黃抗體均具有一定的抗病毒能力。

S蛋白是PEDV表面的一種重要的結構與功能蛋白，在免疫反應中起重要作用，有識別靶細胞及使病毒和細胞膜融合的作用[11]。S蛋白被劃分為S1區(qū)域(1～789位氨基酸)和S2區(qū)域(790～1 383位氨基酸)[12]， S1區(qū)域包括S蛋白的主要中和表位，組成了暴露在PEDV病毒粒子表面的球形胞外功能區(qū)，其中S1D(636～789位氨基酸)是抗原中和表位區(qū)域。S1D區(qū)域中的S1D5(744～759位氨基酸)和S1D6(756～771位氨基酸)被證實為PEDV S蛋白的2個線性表位，而SS2(Y748SNIGVCK755)和SS6(L764QDGQVKI771)分別為S1D5和S1D6 2個區(qū)域的核心表位[13]。Chang等[14]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)S基因的中和表位區(qū)序列信息，推導出PEDV S蛋白中和表位，用之制備的高免血清能夠明顯地抑制PEDV在Vero細胞上的蝕斑形成，初步鑒定了PEDVS基因的一個抗原表位區(qū)(499～638 氨基酸)。Kang等[15]證明韓國株PEDVS基因序列的1 504～1 923 bpK-COE基因是PEDV的中和抗原位點。Cruz等[16]利用噬菌體隨機肽庫鑒定了PEDV S蛋白的一個模擬表位(G1 368PRLQPY1 374)，該區(qū)域位于S蛋白C末端24位氨基酸，能夠誘導機體產(chǎn)生強烈的抗體反應，可能是PEDV的中和表位之一。孫東波[17]利用fd噬菌體展示技術鑒定出了PEDV S蛋白3個新的抗原表位，分別為S1P1(248～280位氨基酸)、S1P2(442～499 位氨基酸)和S1P3(697～638位氨基酸)，其融合蛋白的單因子血清能夠識別Vero細胞培養(yǎng)物中天然的PEDV。PEDVS基因片段PEDV S534(編碼636～789位氨基酸)和PEDVS COE(499～638位氨基酸)重組蛋白已被證明其抗血清均有一定的中和活性，具有潛在的應用價值[17-19]。

為此，本研究利用PEDV S534和PEDV COE 2種重組蛋白，以及PEDV滅活病毒分別作為免疫原制備卵黃抗體，比較其中和效價，以期獲得更加經(jīng)濟高效的PEDV卵黃抗體。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒、宿主菌、病毒、細胞和試驗動物 質(zhì)粒pET32a-PEDV S534、pET32a-COE和大腸桿菌菌株BL21(DE3)及豬流行性腹瀉病毒分離株和其增殖用Vero細胞，均來自南京天邦生物技術有限公司研究所。試驗動物為15只18周齡萊杭蛋雞。

1.1.2 主要試劑 弗氏完全佐劑和不完全佐劑，購自Sigma公司；辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗雞抗體及DAB顯色試劑盒，購自上海生工有限公司；細胞培養(yǎng)基DMEM和血清，購自GIBCO BRL公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.2 免疫原的制備

1.2.1 重組蛋白免疫原 將重組質(zhì)粒pET32a-PEDV S534和pET32a-COE轉(zhuǎn)化表達菌BL21，用含100 g/L氨芐青霉素(Amp)的LB平板37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單克隆至5 mL TB培養(yǎng)基中，搖菌16～18 h后以1∶100(體積比)轉(zhuǎn)入新鮮TB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，至OD600值達到0.6～0.8時加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/mL，誘導6 h后收菌。將菌液離心(6 000 r/min，20 min)，沉淀用PBS懸浮，超聲破碎15 min(工作3 s，間隔2 s)后離心(12 000 r/min，10 min)，分別取上清液和沉淀(用8 mol/L尿素溶液溶解)進行SDS-PAGE分析。包涵體蛋白經(jīng)尿素溶液溶解后加入透析袋中透析復性。復性后的蛋白用鎳離子柱純化，用BCA試劑盒測定純化后的蛋白濃度。將純化后的蛋白與等量的弗氏完全佐劑或不完全佐劑充分乳化，制備PEDV S534和COE抗原。

1.2.2 PEDV病毒免疫原 將1日齡未吃初乳的仔豬人工感染PEDV，出現(xiàn)腹瀉后進行剖殺，取小腸組織用于提取和純化PEDV。參照王金洛等[6]的試驗方法，制備PEDV病毒免疫原。

1.3 卵黃抗體的制備

1.3.1 免疫產(chǎn)蛋雞 在注射抗原前3 d收集雞蛋作為對照組，然后皮下多點注射已制備的免疫原。2種重組蛋白免疫原免疫劑量為首免100 μg/只，二免150 μg/只，三免300 μg/只；PEDV病毒免疫原免疫劑量為首免1 mL/只、二免1.5 mL/只、三免2 mL/只。免疫間隔期均為2周；首免佐劑為弗氏完全佐劑，二免和三免佐劑為弗氏不完全佐劑。三免后10 d開始收集雞蛋，檢測抗體效價，制備卵黃抗體。

1.3.2 卵黃抗體的分離純化 采用硫酸銨梯度沉淀法分離純化卵黃抗體。首先用新潔爾滅對收集的雞蛋進行表面消毒，在無菌條件下破殼，將蛋清倒出，用吸紙將蛋黃表面的蛋清盡量吸凈。然后將蛋黃倒入無菌燒杯中，加入9倍體積的PBS，4 ℃充分攪拌20 min。參照改良的硫酸銨沉淀法[20]，調(diào)節(jié)蛋黃稀釋液pH值為5.11，4 ℃放置12 h后10 000 r/min 離心20 min，收集上清，加入終濃度為0.6 mol/L的Na2SO4，并調(diào)節(jié)pH值為7.5。將該溶液與等體積的PBS混合，攪拌均勻，4 ℃緩慢滴加飽和硫酸銨至飽和度為40%，4 ℃靜置1 h后12 000 r/min 離心30 min，棄上清液，沉淀用原樣品體積的PBS重懸；再次緩慢滴加飽和硫酸銨至飽和度為35%，4 ℃靜置1 h后12 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀用原樣品體積1/2的PBS重懸。采用透析的方法除去卵黃抗體中殘留的鹽離子硫酸銨，用SDS-PAGE分析純化前、后的卵黃抗體純度。

1.4 卵黃抗體的Western-Blotting檢測

取原核表達的蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)(60 V，2 h)至PVDF膜上，用100 g/L脫脂牛奶封閉過夜，TBST洗滌3次；分別以PBS稀釋的PEDV S534和COE卵黃抗體為一抗(稀釋倍數(shù)1∶200，V/V)，37 ℃作用2 h后用TBST洗滌3次；以HRP標記的羊抗雞作為二抗(稀釋倍數(shù)1∶4 000，V/V)，37 ℃反應1.5 h后用TBST洗滌5次。采用DAB試劑盒進行顯色分析。

1.5 卵黃抗體中和效價的測定

病毒半數(shù)細胞感染量(TCID50)的測定：將PEDV病毒原液按密度梯度10-3，10-4，10-5，10-6，10-7和10-8進行稀釋，分別接種Vero細胞，每個稀釋度為1組，每組設5個重復。37 ℃培養(yǎng)，記錄48～96 h病變細胞數(shù)和未病變細胞數(shù)，按Reed-Muech法計算TCID50。

固定病毒稀釋抗體，以每孔100 TCID50病毒量與倍比稀釋(2，4，8，16，32，64，128和256倍)的卵黃抗體37 ℃作用1 h后接種細胞，同時設低倍稀釋的血清對照、正常孔對照及100 TCID50/孔、0.1 TCID50/孔的病毒對照，當100 TCID50/孔全部病變而0.1 TCID50/孔無病變時開始記錄每組的病變細胞數(shù)和未病變細胞數(shù)，計算抗體的中和效價。

2 結果與分析

2.1 PEDV S534和COE基因的原核表達

由圖1可以看出，經(jīng)IPTG誘導后，pET32a-PEDV S534和pET32a-COE重組質(zhì)粒誘導后分別在37和36 ku處出現(xiàn)特異性蛋白條帶(另外2條帶為菌體蛋白)，表達的蛋白存在于沉淀中，上清液中除大腸桿菌菌體蛋白條帶外，不存在目的蛋白。

2.2 卵黃抗體的純化

圖2顯示，制備的3種卵黃抗體經(jīng)硫酸銨梯度沉淀后得到了很好的純化。

2.3 卵黃抗體的Western-Blotting分析

Western-Blotting分析結果(圖3-A、B)顯示，分別以PEDV S534和COE蛋白制備的卵黃抗體作為一抗，能夠分別檢測到分子質(zhì)量為37和36 ku的蛋白條帶，表明已成功制備了2種重組蛋白的特異性卵黃抗體。

圖1 PEDV S534和COE融合蛋白的誘導表達1.COE菌體蛋白裂解后沉淀;2.PEDV S534菌體蛋白裂解后沉淀;3.COE菌體蛋白裂解后上清;4.PEDV S534菌體蛋白裂解后上清;M.蛋白Marker
Fig.1 Expression of PEDV S534and COE fusion proteins 1.Inclusion bodies of COE mycoprotein;2.Inclusion bodies of PEDV S534mycoprotein;3.Supernatant after sonication of COE mycoprotein;4.Supernatant after sonication of PEDV S534mycoprotein;M.Protein marker

圖2 PEDV 3種卵黃抗體的純化效果
1.純化前的PEDV抗原卵黃抗體；2.純化前的S534卵黃抗體；3.純化前的COE卵黃抗體；M.蛋白Marker；4.純化后的PEDV抗原卵黃抗體；5.純化后的S534卵黃抗體；6.純化后的COE卵黃抗體
Fig.2 Purification effects of egg yolk antibodies1.PEDV antigen IgY with no purified;2.S534IgY with no purified;3.COE IgY with no purified;M.Protein Marker;4.PEDV antigen vaccine IgY after purified;5.S534IgY after purified;6.COE IgY after purified

圖3 PEDV融合蛋白S534和COE卵黃抗體的Western-Blotting檢測A.S534卵黃抗體;B.COE卵黃抗體
Fig.3 Western-Blotting analysis on the binding activities of PEDV fusion proteins S534and COE yolk antibodies A.Anti-S534IgY;B.Anti-COE IgY

2.4 中和試驗

中和試驗的效價測定結果顯示，制備的PEDV S534卵黃抗體的中和效價為1∶12，COE卵黃抗體的中和效價為1∶25，PEDV全病毒免疫制備的卵黃抗體的中和效價達到1∶120，而對照組的中和效價低于1∶2，表明制備的卵黃抗體具有一定的中和活性。

3 討 論

PED自1971年被首次報道[21]以來，現(xiàn)已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的最重要傳染病之一。2006年有報道稱，PED開始在免疫豬群中大面積流行，并造成了巨大的經(jīng)濟損失[4]，這在一定程度上說明傳統(tǒng)的疫苗免疫已經(jīng)不能起到很好的保護作用。由于仔豬出生時體內(nèi)沒有免疫球蛋白，因此新生仔豬必須通過母乳來獲得被動免疫[22-23]。卵黃抗體與初乳作用機理相似，能夠直接進入腸道中和病毒，作用快速有效，在無有效藥物或緊急免疫接種疫苗不能在短時間產(chǎn)生免疫保護的情況下，應用抗豬流行性腹瀉卵黃抗體對豬群進行緊急預防是預防豬流行性腹瀉的重要補充措施。

PEDV S蛋白能夠介導感染宿主產(chǎn)生中和抗體。近年來，國內(nèi)外研究人員先后對PEDV S蛋白中和表位的中和活性及構象進行了研究。PEDV韓國株S 蛋白COE基因已在煙草[15]和馬鈴薯[24]中得到表達，用表達的蛋白免疫接種小鼠后，可刺激機體產(chǎn)生有效的系統(tǒng)免疫和黏膜免疫應答，產(chǎn)生的抗體具有中和活性。葛俊偉[25]以PEDV LJB/03株S基因的COE片段為目的基因，經(jīng)大腸桿菌表達后證實COE具有誘導中和抗體產(chǎn)生的作用，經(jīng)干酪乳桿菌表達系統(tǒng)表達后口服免疫接種小鼠，能夠誘導機體產(chǎn)生特異性的sIgA和IgG抗體，血清具有中和活性，中和效價為1∶12。汪淼[26]構建了COE基因的重組乳酸乳球菌表達系統(tǒng)，口服免疫接種動物后能夠有效刺激腸道黏膜的免疫細胞，達到對動物的免疫保護作用，血清中和抗體效價可達1∶90。PEDV是以體液免疫為主的病毒，因而B細胞抗原表位在抗PEDV感染中具有重要意義，孫東波[17]通過試驗鑒定得知PEDV S1區(qū)的S1D(636～789位氨基酸)亞區(qū)是一個免疫優(yōu)勢區(qū)，S1D的GST重組蛋白能介導小鼠產(chǎn)生特異性的抗體，該抗體能夠識別天然的S蛋白，并對PEDV在Vero E6細胞上的復制具有中和作用；同時利用S1D的單克隆抗體，通過S1基因肽庫篩選出2個線性抗原表位，即P744VLVYSNIGVCKSGSI759和S756GSIGYVPLQDGQ-VKI771；進一步的試驗結果表明，S1D5表位的核心序列是Y748SNIGVCK755，S1D6表位的核心序列是L764QDGQVKI771，S1D5和S1D6表位的GST融合蛋白介導小鼠產(chǎn)生的抗體能夠識別天然的S蛋白。Cruz等[16]篩選出了一個PEDV S蛋白模擬構象表位G1 368PRLQPY1 374，中和試驗表明該表位能夠抑制病毒的早期復制，并阻止病毒進入宿主細胞。S1D1、S1D2和S1D3表位的GST融合蛋白均可與PEDV多克隆血清發(fā)生反應，S1D2和S1D3表位的GST融合蛋白介導小鼠產(chǎn)生的抗體能識別天然的S蛋白，S1D1、S1D2和S1D3的串聯(lián)表位S1P123具有更好的抗原性和免疫原性，但融合蛋白產(chǎn)生的抗體無中和活性。

本試驗首次選用PEDV S蛋白的中和表位基因S534和COE為靶基因，原核表達這2種蛋白作為免疫原制備卵黃抗體。中和試驗結果表明，制備的卵黃抗體均具有一定的病毒中和能力，中和效價分別為1∶12和1∶25，但均低于以PEDV全病毒滅活為免疫原制備的卵黃抗體的中和效價。分析其原因，可能是由于PEDV滅活免疫原包含的是PEDV全病毒，全病毒具有病毒基因中所有的中和位點，抗原也具有天然的構象。所以，以PEDV滅活苗為免疫原制備的卵黃抗體完全針對靶病毒，對病毒的中和能力也最強。PEDV S534和COE蛋白均為一段具有中和性抗原的表位蛋白，針對PEDV的中和作用的抗原表位數(shù)量不多，因此以其作為免疫原制備的卵黃抗體對病毒的中和能力也相對較弱。本試驗結果與江馗語[10]對豬瘟病毒4種不同抗原卵黃抗體中和效價的評價結果一致?？筆EDV S534重組蛋白卵黃抗體的中和效價比抗COE重組蛋白的中和效價低，這可能是由于中和表位PEDV S534片段與病毒的結合能力不如COE片段強，這與葛俊偉[25]的試驗結果一致。中和位點的多少及中和位點基因的優(yōu)化可能與重組蛋白作為抗原制備的卵黃抗體的中和效價有密切的關系，本研究為進一步探討PEDV分離株中和表位的變異與疫苗保護性之間的關系提供了新的思路。

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Wang M.Construction of recombinant lactococcus lactis expressing neutraliaing antigenic domain of procine epidemic diarrhea virus [D].Harbin:Northeast Agricultural University,2009.(in Chinese)

Preparation of yolk antibodies against three different antigens of porcine epidemic diarrhe virus

HU Qing-song1,LI Lü-mu1,ZHANG Xiao-fei2,XU Fa-zhi1, DING Xiao-ling1,XU Yan-wei2,DING Wei-min3

(1SchoolofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China;2NanjingTianbangBio-IndustryCO.,LTD,Nanjing，Jiangsu211102,China;3AnhuiAntaiAgriculturalGroupCO.,LTD,Guangde,Anhui242200,China)

【Objective】 This study investigated the ability of yolk antibodies to neutralize three different antigens of PEDV to provide new method and theoretical basis for preparing swine PED yolk antibody.【Method】 Two pairs of primers were designed to clone PEDVS534gene (636-789aa) andCOEgene (499-638aa) before they were inserted into pET32a to acquare recombinant plasmids,pET32a-PEDV S534and pET32a-COE.After the recombinant plasmids were transformed into BL21(DE3),IgY against PEDV was obtained from chicken egg yolk immunized with three different antigens,PEDV S534protein,COE protein and PEDV inactivated virus.Then,their abilities to neutralize PEDV were tested by neutralization test.【Result】 The PEDV S534protein and COE protein were expressed successfully,and Western-Blotting indicated that the immunogenicity of the proteins were high.The virus neutralization test indicated that all three egg yolk antibodies could neutralize PEDV.The anti-PEDV S534IgY neutralization titer was 1∶12,the anti-COE IgY neutralization titer was 1∶25,and the anti-PEDV inactivated virus IgY neutralization titer was 1∶120.【Conclusion】 The anti-PEDV inactivated virus IgY had the highest neutralization titer,followed by the anti-COE IgY and the anti-PEDV S534IgY.

porcine epidemic diarrhea virus(PEDV);prokaryotic expression;egg yolk antibody;neutralization test

時間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.006

2014-03-19

安徽省生豬產(chǎn)業(yè)技術體系營養(yǎng)與飼料研究專項(2012)

胡青松(1987-)，男，江蘇沛縣人，在讀碩士，主要從事豬營養(yǎng)與飼料研究。

李呂木(1956-)，男，安徽和縣人，研究員，博士，博士生導師，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學研究。 E-mail:llm56@ahau.edu.cn

S858.286.4

A

1671-9387(2015)11-0035-06

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.012.html