HPLC法測定清熱涼血軟膏中大黃素、大黃酚的含量

丁科+呂焰+朱濤

【摘 要】 目的：建立清熱涼血軟膏中大黃素、大黃酚的含量測定方法。方法：高效液相色譜法。色譜柱：Dionex Ultimate 3000-C18（4.6mm×250mm，5μm）;流動相：甲醇-0.1%磷酸（80∶20）;檢測波長：254nm;流速：1.0ml/min。結(jié)果：大黃素在0.010～0.200μg/ml范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為Y=59.069X+0.0301（r=0.9999），平均加樣回收率為100.33%，RSD為1.743% （n=5）;大黃酚在0.020～0.400μg/ml范圍內(nèi)線形良好，回歸方程為Y=88.598X+0.1158（r=0.9999），平均加樣回收率為100.253%，RSD為1.942% （n=5）。結(jié)論：本方法操作簡便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以用于清熱涼血軟膏的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 清熱涼血軟膏;大黃素;大黃酚;高效液相色譜法

【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）15-0012-02

Determination of the Contents of Emodin and Chrysophonl in Qingreliangxue Ointment by HPLC

DING Ke，LV Yan， ZHU Tao

Department of Chinese Pharmacy，The First Affiliated hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310005，China

Abstract：Objective To establish a HPLC method to determinate the contents of Emodin and Chrysophanol in Qingreliangxue Ointment. Methods The analysis was used on a Dionex Ultimate 3000-C18（4.6mm×150mm，5μm）;methanol-0.1%H3PO4（80∶20） as mobile phase; the flow rate was 1.0mL/min;the detection wavelength was 254 nm. Results A good linearity can be found in the range of 0.010～0.200μg （r=0.9999） in Emodin，the average recovery rate was 100.33%，RSD was1.743%（n=5）;the linear ranges of chrysohonl at 0.020～0.400μg （r=0.9999），the average recovery rate was 100.253%，RSD was 1.942%（n=5）.Conclusion This method is reliable， rapid and accurate. It can be used to control the quality of Qingreliangxue Ointment.

Keywords：Qingreliangxue Ointment; Emodin;Chrysophanol; HPLC

清熱涼血軟膏（以下簡稱“清涼膏”）主要由大黃、當、紫草等中藥組成，具有清熱解毒、消腫止痛、活血散淤等功效，臨床適用于跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛，丹毒皰疹，特異性炎癥等病癥，是浙江省中醫(yī)院傳統(tǒng)中藥軟膏（浙準制字20100233）。清涼膏前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，含有大黃成分的制劑比未含有大黃成分的中間體要產(chǎn)生更加明顯的藥理活性，故本文對清涼膏采用高效液相色譜法，測定其中主要成分大黃素、大黃酚的含量，并建立一種快速、靈敏、準確的質(zhì)量檢測方法，并為以后制劑改良研發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 儀器與試劑

Inertsil ODS-SP高效液相色譜系統(tǒng)（美國Thermo Fisher）;KQ-500DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/DLSB-5低溫冷卻循環(huán)泵（德國Digital）。大黃素（批號：110756-201110）、大黃酚對照品（批號：110796-201118）均由中國藥品生物制品檢定所提供;清熱涼血軟膏（批號：121217，130109，130110，1320226，130305，浙江省中醫(yī)院）。甲醇（色譜純，美國Tedia）;重蒸水;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱：Dionex Ultimate 3000-C18（4.6mm×250mm，5μm）;流動相：甲醇-0.1%磷酸（80∶20）;檢測波長：254nm;流速：1.0ml/min;柱溫 25℃;進樣量10μl。在本實驗條件下，大黃素、大黃酚與其他組分分離完全，分離度R>1.5，理論塔板數(shù)以大黃素峰計不低于5000。

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取大黃素、大黃酚對照品適量，加甲醇分別制成每1ml含大黃酸、大黃素各30μg;分別精密量取大黃素對照品溶液1ml，大黃酚對照品溶液2ml，混勻，即得（每1ml含大黃素10μg，大黃酚20μg）混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的清熱涼血軟膏2g，置50ml錐形瓶中，加入甲醇25ml稱定重量，加熱回流30min，放冷，冷水浴冷卻并用甲醇補足減失重量;精密量取濾液5mL置50ml錐形瓶中，揮去甲醇，加2.5mol/l硫酸溶液10ml，超聲處理5min，再加氯仿10ml加熱回流1h，置分液漏斗，并用少量氯仿洗滌，并入分液漏斗，酸液用氯仿提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓揮發(fā)溶劑至干，取殘渣，精密加甲醇10ml，溶解，取續(xù)濾液得供試品溶液。endprint

2.2.3 缺大黃陰性對照溶液的制備 取未加入大黃粉前的清涼膏中間體，按供試品溶液的制備方法制成缺大黃陰性對照品溶液。

2.3 前處理工藝的考察 分別考察加熱回流和超聲震蕩兩種提取方法，兩者所測結(jié)果接近，加熱回流法操作簡便耗時長，超聲提取耗時短對儀器操作要求較高;考察提取時間因素的影響，20min、30min、1h、2h提取后測定結(jié)果，其中30min處理后測定結(jié)果開始穩(wěn)定;對同批樣品以常溫，加熱，冰水浴冷卻[1、2]進行提取處理，發(fā)現(xiàn)以冰水浴處理后含量測定明顯高于其他方法，且結(jié)果重復(fù)性較好;本文參考《中國藥典》2010版（一部）大黃藥材測定的流動相體系[3]，在流動相中添加少量酸可以使色譜峰基線分離并峰形對稱，考察了鹽酸和硫酸并通過調(diào)整流動相的配比，使大黃素、大黃酚的分離度、拖尾因子等符合系統(tǒng)適應(yīng)性試驗的要求，最終確定最佳流動相為甲醇-0.1%磷酸（80∶20），以2.5mol/l硫酸溶液為酸性添加劑[4]。

2.4 空白試驗 取大黃素、大黃酚對照品溶液、清涼膏供試品溶液及缺大黃的陰性對照品溶液，在上述色譜條件下分別進樣10μl（圖1）。結(jié)果表明：對照品溶液和清涼膏供試品溶液色譜圖在保留時間10、15min出現(xiàn)大黃素、大黃酚的色譜峰;缺大黃陰性對照品溶液色譜圖在相同保留時間無色譜峰，說明其他成分對測定無干擾。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取大黃素、大黃酚混合對照溶液（每1ml含大黃素10μg，大黃酚20μg），吸取1，3，10，15，20μl注入高效液相色譜儀，在254nm測定大黃素、大黃酚的峰面積。以對照品量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：大黃素Y=59.069X+0.0301（r=0.9999），大黃素Y=88.598X+0.1158（r=0.9999），結(jié)果表明大黃素在0.010～0.200μg/ml、大黃酚在0.020～0.400μg/ml呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密稱取混合對照品溶液10μl，按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)進樣6次測量峰值，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.21%和0.10%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批號供試品溶液（130110），按上述供試溶液測定方法，分別于0，1，2，4，12小時進樣10μl測定，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為2.25%、0.13%，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗 取同一批號清涼膏（130110）5份，按上述供試溶液制備和測定方法，進樣 10μl測定，結(jié)果顯示大黃素的平均含量為0.0282mg/g，RSD為1.91%;大黃酚的平均含量為0.0788mg/g，RSD為2.16%，表明重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的清涼膏樣品1.0g（批號130110），分別加入每1ml含大黃素10μg、大黃酚20μg的對照品溶液15ml，按上述供試溶液制備和測定方法平行測試5份，計算加樣回收率，結(jié)果見表1、2。大黃素的加樣回收率在98.26%～102.33%之間，平均回收率為100.33%，RSD為1.743%;大黃酚的加樣回收率在98.33～102.96%之間，平均回收率為100.252%，RSD為1.942%。

2.10 樣品的含量測定 取不同的5個批號干燥至恒重的清涼膏2g，按“1.3.2”的方法在上述色譜條件下進行測定，每個樣品平行測定3次，計算樣品中大黃素、大黃酚的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

清熱涼血軟膏為中藥復(fù)方制劑，制樣過程中其基質(zhì)蜂蠟較難去除，本試驗借鑒冰水浴冷卻過濾的方法來排除干擾，取得良好效果。本文參照《中國藥典》外用膏劑相關(guān)質(zhì)量標準，采用高效液相色譜系統(tǒng)，以Dionex Ultimate 3000-C18為固定相，甲醇-0.1%磷酸（80∶20）為流動相，初步建立了清涼膏中主要指標成分大黃素、大黃酚的含量色譜測定方法。該方法與紫外分光法等其他方法相比較，檢驗先進，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，可優(yōu)先用于清涼膏的質(zhì)量控制。

參考文獻

[1]鄭艷春，楊冬麗，崔雅慧，等.HPLC測定新健胃包芯片中大黃素大黃酚含量[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6（22）：127-129.

[2]尹華，盛云杰.HPLC測定六味安消膠囊中大黃素、大黃酚的含量[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（10）：1940-1942.

[3]國家藥典委.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[4]陳志琦. HPLC測定益心康泰膠囊中大黃素大黃酚含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（10）：88-89.

（收稿日期：2014.06.08）endprint

2.2.3 缺大黃陰性對照溶液的制備 取未加入大黃粉前的清涼膏中間體，按供試品溶液的制備方法制成缺大黃陰性對照品溶液。

2.3 前處理工藝的考察 分別考察加熱回流和超聲震蕩兩種提取方法，兩者所測結(jié)果接近，加熱回流法操作簡便耗時長，超聲提取耗時短對儀器操作要求較高;考察提取時間因素的影響，20min、30min、1h、2h提取后測定結(jié)果，其中30min處理后測定結(jié)果開始穩(wěn)定;對同批樣品以常溫，加熱，冰水浴冷卻[1、2]進行提取處理，發(fā)現(xiàn)以冰水浴處理后含量測定明顯高于其他方法，且結(jié)果重復(fù)性較好;本文參考《中國藥典》2010版（一部）大黃藥材測定的流動相體系[3]，在流動相中添加少量酸可以使色譜峰基線分離并峰形對稱，考察了鹽酸和硫酸并通過調(diào)整流動相的配比，使大黃素、大黃酚的分離度、拖尾因子等符合系統(tǒng)適應(yīng)性試驗的要求，最終確定最佳流動相為甲醇-0.1%磷酸（80∶20），以2.5mol/l硫酸溶液為酸性添加劑[4]。

2.4 空白試驗 取大黃素、大黃酚對照品溶液、清涼膏供試品溶液及缺大黃的陰性對照品溶液，在上述色譜條件下分別進樣10μl（圖1）。結(jié)果表明：對照品溶液和清涼膏供試品溶液色譜圖在保留時間10、15min出現(xiàn)大黃素、大黃酚的色譜峰;缺大黃陰性對照品溶液色譜圖在相同保留時間無色譜峰，說明其他成分對測定無干擾。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取大黃素、大黃酚混合對照溶液（每1ml含大黃素10μg，大黃酚20μg），吸取1，3，10，15，20μl注入高效液相色譜儀，在254nm測定大黃素、大黃酚的峰面積。以對照品量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：大黃素Y=59.069X+0.0301（r=0.9999），大黃素Y=88.598X+0.1158（r=0.9999），結(jié)果表明大黃素在0.010～0.200μg/ml、大黃酚在0.020～0.400μg/ml呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密稱取混合對照品溶液10μl，按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)進樣6次測量峰值，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.21%和0.10%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批號供試品溶液（130110），按上述供試溶液測定方法，分別于0，1，2，4，12小時進樣10μl測定，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為2.25%、0.13%，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗 取同一批號清涼膏（130110）5份，按上述供試溶液制備和測定方法，進樣 10μl測定，結(jié)果顯示大黃素的平均含量為0.0282mg/g，RSD為1.91%;大黃酚的平均含量為0.0788mg/g，RSD為2.16%，表明重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的清涼膏樣品1.0g（批號130110），分別加入每1ml含大黃素10μg、大黃酚20μg的對照品溶液15ml，按上述供試溶液制備和測定方法平行測試5份，計算加樣回收率，結(jié)果見表1、2。大黃素的加樣回收率在98.26%～102.33%之間，平均回收率為100.33%，RSD為1.743%;大黃酚的加樣回收率在98.33～102.96%之間，平均回收率為100.252%，RSD為1.942%。

2.10 樣品的含量測定 取不同的5個批號干燥至恒重的清涼膏2g，按“1.3.2”的方法在上述色譜條件下進行測定，每個樣品平行測定3次，計算樣品中大黃素、大黃酚的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

清熱涼血軟膏為中藥復(fù)方制劑，制樣過程中其基質(zhì)蜂蠟較難去除，本試驗借鑒冰水浴冷卻過濾的方法來排除干擾，取得良好效果。本文參照《中國藥典》外用膏劑相關(guān)質(zhì)量標準，采用高效液相色譜系統(tǒng)，以Dionex Ultimate 3000-C18為固定相，甲醇-0.1%磷酸（80∶20）為流動相，初步建立了清涼膏中主要指標成分大黃素、大黃酚的含量色譜測定方法。該方法與紫外分光法等其他方法相比較，檢驗先進，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，可優(yōu)先用于清涼膏的質(zhì)量控制。

參考文獻

[1]鄭艷春，楊冬麗，崔雅慧，等.HPLC測定新健胃包芯片中大黃素大黃酚含量[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6（22）：127-129.

[2]尹華，盛云杰.HPLC測定六味安消膠囊中大黃素、大黃酚的含量[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（10）：1940-1942.

[3]國家藥典委.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[4]陳志琦. HPLC測定益心康泰膠囊中大黃素大黃酚含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（10）：88-89.

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2.2.3 缺大黃陰性對照溶液的制備 取未加入大黃粉前的清涼膏中間體，按供試品溶液的制備方法制成缺大黃陰性對照品溶液。

2.3 前處理工藝的考察 分別考察加熱回流和超聲震蕩兩種提取方法，兩者所測結(jié)果接近，加熱回流法操作簡便耗時長，超聲提取耗時短對儀器操作要求較高;考察提取時間因素的影響，20min、30min、1h、2h提取后測定結(jié)果，其中30min處理后測定結(jié)果開始穩(wěn)定;對同批樣品以常溫，加熱，冰水浴冷卻[1、2]進行提取處理，發(fā)現(xiàn)以冰水浴處理后含量測定明顯高于其他方法，且結(jié)果重復(fù)性較好;本文參考《中國藥典》2010版（一部）大黃藥材測定的流動相體系[3]，在流動相中添加少量酸可以使色譜峰基線分離并峰形對稱，考察了鹽酸和硫酸并通過調(diào)整流動相的配比，使大黃素、大黃酚的分離度、拖尾因子等符合系統(tǒng)適應(yīng)性試驗的要求，最終確定最佳流動相為甲醇-0.1%磷酸（80∶20），以2.5mol/l硫酸溶液為酸性添加劑[4]。

2.4 空白試驗 取大黃素、大黃酚對照品溶液、清涼膏供試品溶液及缺大黃的陰性對照品溶液，在上述色譜條件下分別進樣10μl（圖1）。結(jié)果表明：對照品溶液和清涼膏供試品溶液色譜圖在保留時間10、15min出現(xiàn)大黃素、大黃酚的色譜峰;缺大黃陰性對照品溶液色譜圖在相同保留時間無色譜峰，說明其他成分對測定無干擾。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取大黃素、大黃酚混合對照溶液（每1ml含大黃素10μg，大黃酚20μg），吸取1，3，10，15，20μl注入高效液相色譜儀，在254nm測定大黃素、大黃酚的峰面積。以對照品量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：大黃素Y=59.069X+0.0301（r=0.9999），大黃素Y=88.598X+0.1158（r=0.9999），結(jié)果表明大黃素在0.010～0.200μg/ml、大黃酚在0.020～0.400μg/ml呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密稱取混合對照品溶液10μl，按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)進樣6次測量峰值，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.21%和0.10%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批號供試品溶液（130110），按上述供試溶液測定方法，分別于0，1，2，4，12小時進樣10μl測定，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為2.25%、0.13%，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗 取同一批號清涼膏（130110）5份，按上述供試溶液制備和測定方法，進樣 10μl測定，結(jié)果顯示大黃素的平均含量為0.0282mg/g，RSD為1.91%;大黃酚的平均含量為0.0788mg/g，RSD為2.16%，表明重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的清涼膏樣品1.0g（批號130110），分別加入每1ml含大黃素10μg、大黃酚20μg的對照品溶液15ml，按上述供試溶液制備和測定方法平行測試5份，計算加樣回收率，結(jié)果見表1、2。大黃素的加樣回收率在98.26%～102.33%之間，平均回收率為100.33%，RSD為1.743%;大黃酚的加樣回收率在98.33～102.96%之間，平均回收率為100.252%，RSD為1.942%。

2.10 樣品的含量測定 取不同的5個批號干燥至恒重的清涼膏2g，按“1.3.2”的方法在上述色譜條件下進行測定，每個樣品平行測定3次，計算樣品中大黃素、大黃酚的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

清熱涼血軟膏為中藥復(fù)方制劑，制樣過程中其基質(zhì)蜂蠟較難去除，本試驗借鑒冰水浴冷卻過濾的方法來排除干擾，取得良好效果。本文參照《中國藥典》外用膏劑相關(guān)質(zhì)量標準，采用高效液相色譜系統(tǒng)，以Dionex Ultimate 3000-C18為固定相，甲醇-0.1%磷酸（80∶20）為流動相，初步建立了清涼膏中主要指標成分大黃素、大黃酚的含量色譜測定方法。該方法與紫外分光法等其他方法相比較，檢驗先進，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，可優(yōu)先用于清涼膏的質(zhì)量控制。

參考文獻

[1]鄭艷春，楊冬麗，崔雅慧，等.HPLC測定新健胃包芯片中大黃素大黃酚含量[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6（22）：127-129.

[2]尹華，盛云杰.HPLC測定六味安消膠囊中大黃素、大黃酚的含量[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（10）：1940-1942.

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[4]陳志琦. HPLC測定益心康泰膠囊中大黃素大黃酚含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（10）：88-89.

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