308 nm激光聯(lián)合胡椒堿促進(jìn)毛囊外根鞘無色素黑色素細(xì)胞黑色素合成

吳棟杰

(廣西柳州市人民醫(yī)院皮膚性病科 545001)

論著·基礎(chǔ)研究

308 nm激光聯(lián)合胡椒堿促進(jìn)毛囊外根鞘無色素黑色素細(xì)胞黑色素合成

吳棟杰

(廣西柳州市人民醫(yī)院皮膚性病科 545001)

目的 研究308 nm激光聯(lián)合胡椒堿對毛囊外根鞘無色素黑色素細(xì)胞(AMMC)黑色素合成及TRP-1、TRP-2 蛋白表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)的AMMC分為聯(lián)合療法組、308 nm準(zhǔn)分子激光組、胡椒堿組、陽性對照組及空白對照組，作用24、72、120 h，測定黑色素水平，激光共聚焦顯微鏡觀察并定量分析細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶TRP-1、TRP-2的表達(dá)情況。結(jié)果聯(lián)合治療組、308 nm準(zhǔn)分子激光組、胡椒堿組、陽性對照組均不同程度地促進(jìn)黑色素合成，其中以聯(lián)合治療組促進(jìn)作用最強。聯(lián)合治療組和胡椒堿組的0.5 mmol/L胡椒堿在72 h內(nèi)對黑色素水平促進(jìn)作用最明顯。對于TRP-1的表達(dá)，濃度為0.5 mmol/L的胡椒堿即可以對其產(chǎn)生促進(jìn)作用，但對TRP-2生成無促進(jìn)作用。308 nm準(zhǔn)分子激光對TRP-1、TRP-2生成均有促進(jìn)作用。結(jié)論308 nm準(zhǔn)分子激光聯(lián)合胡椒堿能促進(jìn)AMMC細(xì)胞的黑色素合成。

308 nm激光；胡椒堿；黑素細(xì)胞，無色素；毛囊外根鞘；黑色素合成

本研究前期實驗對小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞黑色素合成研究中，應(yīng)用308 nm激光結(jié)合胡椒堿對其作用進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)果具有較強的促黑色素合成作用。本文繼續(xù)深入研究聯(lián)合治療對毛囊外根鞘無色素黑色素細(xì)胞(AMMC)黑色素合成及TRP-1、TRP-2 蛋白表達(dá)的影響，并對其中可能的作用機制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 美國Gibco公司生產(chǎn)的RPMI 1640培養(yǎng)基、美國Sigma公司生產(chǎn)的胰蛋白酶和二甲基亞砜(DMSO)、杭州四季青生物材料有限公司生產(chǎn)的新小牛血清以及美國Amersco公司生產(chǎn)的脫氧膽酸鈉，剩余試劑則全部都是分析純。美國Sigma公司的左旋多巴(DL-Dopa)以及蘑菇酪氨酸酶；美國Corning公司生產(chǎn)的96孔培養(yǎng)板、澳大利亞Clinibio公司生產(chǎn)的Clinibio 128C酶聯(lián)免疫檢測儀以及上海精密分析儀器有限公司生產(chǎn)的722分光光度計。DL-Dopa采用三蒸水將其進(jìn)行配置成溶液2.5 mL，蘑菇酪氨酸酶則被制成25 IU/mL。在患者治療中，所選用的則為美國Photomedex公司生產(chǎn)的Xtrac巔峰準(zhǔn)分子激光系統(tǒng)，其波長為305 nm，借助于氯化氙氣體進(jìn)行工作。

1.1.2 藥品 將中國藥品生物檢驗提供的胡椒堿配備成原液，其濃度為20 mg/mL，并將其放置在-20 ℃保存。在臨時使用中，可以采用培養(yǎng)液調(diào)整濃度，根據(jù)既往研究將胡椒堿的最終濃度分別確定為1.0、0.5、0.1 mmol/L[1]。江蘇潥陽制藥廠生產(chǎn)的8-甲氧補骨脂素作為陽性對照藥，將其采用DMSO溶解。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) AMMC放置在RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基中含有10%小牛血清、100 μg/ mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素，其培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，細(xì)胞生長達(dá)到95%融合時，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，采用椎蟲藍(lán)染色體法進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，并在250 mL玻璃培養(yǎng)瓶中進(jìn)行接種，接種密度1×104/cm2。接種24 h后，即可以采用含有藥物的新鮮培養(yǎng)基，對其再次進(jìn)行72 h孵育，收獲、計數(shù)細(xì)胞，將其均分成兩份，進(jìn)行黑色素水平測定和激光共聚焦熒光定量分析。為了降低培養(yǎng)基中其他成分對結(jié)果的影響，采用不含小牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基在實施實驗之前，將進(jìn)行一次換液。

1.2.2 實驗分組 將其分成5組，第1組為聯(lián)合療法組，照射能量為300 mJ/cm2的308 nm激光，根據(jù)作者此前的研究結(jié)果設(shè)定照射時間為7 s，并結(jié)合胡椒堿，其濃度分別為1.0、0.5、0.1 mmol/L；第2組為308 nm準(zhǔn)分子激光組，單純能量照射，方法同聯(lián)合療法組；第3組則為胡椒堿組，單純使用胡椒堿，方法同聯(lián)合療法組；第4組為陽性對照組，采用308 nm準(zhǔn)分子激光結(jié)合8-甲氧補骨脂素(0.1 mmol/L)；第5組則為空白對照組，單純加入溶媒介質(zhì)。

1.2.3 黑色素水平測定 依照Ando等[2]方法對黑色素水平進(jìn)行測定實施改良，在細(xì)胞收獲之后，細(xì)胞計術(shù)采用血細(xì)胞計數(shù)器對其進(jìn)行4次測量取平均數(shù)，PBS清洗2次，加入雙蒸水200 μL懸浮細(xì)胞，再加入1∶1的乙醇和乙醚1 mL混合液，室溫下放置15 min，采用3 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行5 min離心，經(jīng)過沉淀之后，在其中加入1 mL的1 mol/L NaOH(其中含有10% DMSO)，再將其在80 ℃條件下放置30 min，進(jìn)行黑色素溶解，在NaOH中添加4 mL雙蒸水進(jìn)行稀釋(濃度為0.2 mol/L)。采用分光光度計進(jìn)行測量，黑色素水平的計算方法：(藥物處理組A475/細(xì)胞數(shù))/(空白對照組A475/細(xì)胞數(shù))×100。各個實驗重復(fù)4次。

1.2.4 激光共聚焦熒光定量分析 按照文獻(xiàn)[3]的方法,對其實施熒光定量分析以及激光共聚焦顯微鏡觀察。將各組細(xì)胞種植于蓋玻片上3、5、7 d，PBS清洗3次，每次5 min，在室溫中4%多聚甲醛液固定，養(yǎng)血清封閉細(xì)胞10 min，隨后吸掉。加入一抗溶液：兔抗人TRP2抗體(1∶150)、兔抗人TRP1抗體(1∶150)以及兔抗人酪氨酸酶抗體(1∶150)，37 ℃下孵育60 min。PBS沖洗3次，每次5 min，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗溶液(1∶100)，37 ℃孵育30 min。PBS緩沖液沖洗蓋玻片3次，濾紙吸掉PBS緩沖液，在待測樣品中分別加入0.2 mL PBS，激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察和分析，激發(fā)光波長選擇488 mm。

2 結(jié) 果

2.1 308 nm準(zhǔn)分子激光及胡椒堿的影響作用 傳代培養(yǎng)的AMMC形狀是紡錘形。在通過胡椒堿和308 nm準(zhǔn)分子激光照射之后，其細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞體增大，樹狀突起增加和延長,見圖1。

A:傳代培養(yǎng)的AMMC；B:308 nm準(zhǔn)分子激光聯(lián)合胡椒堿處理的AMMC。

圖1 308 nm EL聯(lián)合胡椒堿對AMMC細(xì)胞形態(tài)的影響(激光共聚焦顯微鏡×100)

2.2 不同組對AMMC活性和黑素合成的影響 胡椒堿能夠?qū)谒厮降脑黾赢a(chǎn)生促進(jìn)作用，作用最明顯的是在72 h，使用0.5 mmol/L胡椒堿的聯(lián)合治療組、胡椒堿組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對比分析0.1 mmol/L 8-甲氧補骨脂素作用120 h和0.5 mmol/L胡椒堿作用72 h，其黑素量的增加顯著(t=3.50,P<0.05)。見表1。

表1 各組AMMC黑色素水平

a：P<0.05，b：P<0.01，與空白對照組同時間點比較；c：P<0.05，與陽性對照組同時間點比較；-：此項無數(shù)據(jù)。

表2 0.5 mmol/L胡椒堿作用72 h后對AMMC黑素合成相關(guān)酶的影響

2.3 不同觀察組對AMMC TRP-1、TRP-2蛋白表達(dá)的影響 和空白對照組比較，胡椒堿組黑色素細(xì)胞TRP-1的表達(dá)量明顯增高(t=6.34,P<0.01);TRP-2的表達(dá)量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。308 nm準(zhǔn)分子激光組對TRP-1、TRP-2均有促進(jìn)作用，較空白對照組高(t=10.64,P<0.01;t=9.32,P<0.01)。見表2。

3 討 論

在臨床上，白癜風(fēng)是一種非常常見的皮膚色素脫失性疾病，對患者的容貌具有嚴(yán)重影響。雖然臨床中不斷出現(xiàn)新的治療方法，但是其治療效果依然不盡如人意，因此需要進(jìn)一步對其臨床治療方法和理論進(jìn)行完善。其中白癜風(fēng)的發(fā)病重點是黑色素細(xì)胞(MC)的缺失。MC發(fā)育學(xué)研究已證實：位于毛囊外根鞘的AMMC是表皮MC的主要來源-儲庫，在多種因素作用下，休眠狀態(tài)AMMC被活化，經(jīng)過黏附等一系列環(huán)節(jié)遷移到表皮并進(jìn)一步增殖、活化，完成表皮著色過程[4]。這一過程也同樣存在于白癜風(fēng)復(fù)色中。臨床現(xiàn)象也支持上述觀點。白癜風(fēng)白斑的復(fù)色開始是從毛囊口，在其周圍一開始有色素性皮島的形成，繼而逐漸擴大。因此促進(jìn)AMMC的活化、黏附對增加白癜風(fēng)皮損區(qū)MC的數(shù)量和功能極為關(guān)鍵。在白癜風(fēng)臨床治療中，308 nm準(zhǔn)分子激光是新出現(xiàn)的一種治療手段，其光源的組成則主要是氯原子和疝原子形成的二聚體，之后將中波紫外線波長范圍[5]的脈沖氣體激光連續(xù)發(fā)出。目前308 nm準(zhǔn)分子激光在臨床治療中的良好效果已經(jīng)得到國內(nèi)外臨床的統(tǒng)一公認(rèn)[6-7]。但是關(guān)于其治療作用機制，臨床研究還集中在其對T細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用以及其對角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的MC抑制的干預(yù)作用方面，另外對于其能夠?qū)MMC產(chǎn)生直接影響也具有研究，但是關(guān)于黑色素生成的促進(jìn)作用研究不廣泛。

MC合成黑色素過程復(fù)雜，在其合成過程中酪氨酸酶占有重要地位，在上調(diào)生物合成過程中，很多藥物可通對這種限速酶的分子結(jié)構(gòu)實施翻譯后的重修飾，以加強其生物學(xué)活性，促進(jìn)其作用的發(fā)揮[8-10]。在絡(luò)氨酸酶基因中TRP-1以及TRP-2共同屬于是其超家族成員，其對于黑色素化合過程的后續(xù)步驟具有催化作用，其和絡(luò)氨酸酶在黑色素細(xì)胞中的存在形式則為多酶復(fù)合體，并且其復(fù)合體具有一定的穩(wěn)定作用。其中TRP-1的催化作用比較弱，經(jīng)過研究只有在含有黑色素的細(xì)胞中，才會有TRP-1 mRNA的存在，因此也就能夠說明在優(yōu)黑色素生成過程中，TRP-1具有重要作用[11]。TRP-2則是在多巴色素轉(zhuǎn)變?yōu)?、6-二羥基吲哚-2-羧酸(DHICA)起催化作用,控制著DHICA/DHI的比例,具有加速黑色素生成作用。激光共聚焦定量分析熒光染色后的AMMC細(xì)胞TRP-1和TRP-2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)胡椒堿作用后TRP-1的表達(dá)量較空白對照高(P<0.01)，而TRP-2的表達(dá)量與空白對照組無差異(P>0.05)，這與馬慧軍等[12]、方俊杰等[13]的結(jié)論一致。提示胡椒堿的促表皮MC黑色素合成的作用可能通過上調(diào)TRP-1的表達(dá)發(fā)揮作用而與TRP-2無明顯關(guān)系。因為TRP-1和優(yōu)黑色素生成關(guān)系較為密切，因此我們也就能夠預(yù)測胡椒堿對于MC中的優(yōu)黑色素合成具有促進(jìn)作用[14]。另外，觀察結(jié)果顯示，308 nm準(zhǔn)分子激光對TRP-1、TRP-2均有促進(jìn)作用，對黑色素合成有明顯促進(jìn)作用。

研究結(jié)果表明，308 nm準(zhǔn)分子激光聯(lián)合胡椒堿對AMMC黑色素合成及TRP-1、TRP-2 蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用較空白對照組有明顯增加。本次研究為白癜風(fēng)的臨床治療提供新的方法，同時還確定了聯(lián)合胡椒堿促進(jìn)308 nm準(zhǔn)分子激光黑色素的生成作用以及其對AMMC的直接活化作用，為以后的研究提供了條件。

[1]馬慧軍，朱文元，王大光．胡椒堿等6種中藥單體促進(jìn)黑素瘤Cloudman S91細(xì)胞株黑素合成的研究[J]．臨床皮膚科雜志，2004，33(3)：145-147．

[2]Ando H,Kondoh H,Ichihashi M,et al.Approaches to indentify inhibitor of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase [J].J Invest Dermatol,2007,127(4):751-761.

[3]馬慧軍，朱文元，王大光．甲氧沙林對體外培養(yǎng)的人毛囊外根鞘無色素黑素細(xì)胞的激活作用[J]．臨床皮膚科雜志，2004，33(8)：471-473．

[4]Rafael F.Vitiligo and the melanocyte reservoir[J].Indian J Dermatol,2009,54(4):313-318.

[5]Al-Shobaili HA.Treatment of vitiligo patients by excimer laser improves patients' quality of Life[J].J Cutan Med Surg,2014,18(5):1-7.

[6]Faria AR,Tarle RG,Dellatorre G,et al.Vitiligo-part 2-classification,histopathology and treatment[J].An Bras Dermatol,2014,89(5):784-790.

[7]汪亞華，袁鋒，倪娜．表皮細(xì)胞移植術(shù)聯(lián)合308nm準(zhǔn)分子激光治療白癜風(fēng)的臨床觀察[J]．安徽醫(yī)學(xué)，2012，33(9)：1147-1149．

[8]Iga N,Otsuka A,Tanioka M,et al.Improvement of Anti-TNF-α Antibody-Induced palmoplantar pustular psoriasis using a 308-nm excimer light[J].Case Rep Dermatol,2012,4(3):261-264.

[9]Alhowaish AK,Dietrich N,Onder MA.Effectiveness of a 308-nm excimer laser in treatment of vitiligo:a review[J].Lasers Med Sci,2013,28(3):1035-1041.

[10]Wang F,Cao Y,Zhao W,et al.Taxol inhibits melanoma metastases through apoptosis induction,angiogenesis inhibition,and restoration of E-cadherin and nm23 expression[J].J Pharmacol Sci，2003,93(2):197-203.

[11]Shirasugi I,Kamada M,Matsui T,et al.Sulforaphane inhibited melanin synthesis by regulating tyrosinase gene expression in B16 mouse melanoma cells[J].Biosci Biotechnol Biochem,2010,74(3):579-582.

[12]馬慧軍，朱文元，王大光，等．中藥單體胡椒堿促進(jìn)表皮黑素細(xì)胞黑素合成的實驗研究[J]．臨床皮膚科雜志，2005，34(1)：14-16．

[13]方俊杰,楊衛(wèi)忠.抗氧化劑治療動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血研究進(jìn)展[J].中外健康文摘,2010,07(35):30-31.

[14]吳一菲,曹萍,王曉川，等.308 nm激光聯(lián)合胡椒堿在白癜風(fēng)動物模型中的應(yīng)用研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2013,51(28):13-15.

308 nm excimer laser combined with piperine activated the production of melanin in amelanotic melanocytes in outer root sheath of hair

WuDongjie

(DepartmentofSkinVenereal,People′sHospitalofLiuzhouCity,Liuzhou,Guangxi545001,China)

Objective To study the mechanism of 308 nm excimer laser combined with piperine activated the production of melanin in amelanotic melanocytes in outer root sheath of hair(AMMC),and promote the expression of TRP-1、TRP-2 protein.Methods AMMC were in incubated for 24、72、120 h in different groups(combination therapy group,the 308 nm excimer laser group,the piperine group,the positive control group and the control group).Then the melanin content was measured.The expression change of TRP-1 and TRP-2 in cells were observed by laser scanning confocal microscopy.Results Four groups increased the AMMC cellular melanin content.Four different groups could promote melanin content at different degrees.The combination therapy group played the strongest role in promoting function.And the function was the most obviously in 24 h,it also was concentration dependent.0.5 mmol/L piperine in combination group and piperine group could produce promoting effect of within 72 h on the expression of TRP-1,but its role was not evident in the expression of TRP-2.308 nm excimer laser had effects both on TRP 1 and TRP 2.Conclusion 308 nm excimer laser combination with piperine can increase the activation of amelanotic melanocytes in outer root sheath of hair.

308 nm laser;piperine;melanocyte,amelanotic;outer root sheath of hair;melanogenesis

吳棟杰(1980-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事皮膚性病研究。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.18.008

R739.5

A

1671-8348(2015)18-2471-03

2015-01-11

2015-03-16)