體外共培養(yǎng)體系中膽管癌細(xì)胞對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞b-FGF和VEGF表達(dá)的影響

李 薇，楊 蕓，宋富強(qiáng)，馮亞星，李 昆

(成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究與保障中心,成都 610083)

論著·基礎(chǔ)研究

體外共培養(yǎng)體系中膽管癌細(xì)胞對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞b-FGF和VEGF表達(dá)的影響

李 薇，楊 蕓，宋富強(qiáng)，馮亞星，李 昆△

(成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究與保障中心,成都 610083)

目的 探討體外共培養(yǎng)體系中膽管癌細(xì)胞(QBC939)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法建立膽管癌QBC939細(xì)胞與HUVEC體外共培養(yǎng)體系，采用CCK-8法檢測共培養(yǎng)不同時(shí)相HUVEC的增殖；ELISA檢測共培養(yǎng)上清液中b-FGF含量；qRT-PCR 和Western blot 檢測共培養(yǎng)不同時(shí)相點(diǎn)HUVEC細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果共培養(yǎng)后12、24、48 h和72 h，HUVEC增殖較對(duì)照組顯著增高(P<0.01)。與0 h組比較，共培養(yǎng)12、24、48 h 上清液中b-FGF含量顯著增高(P<0.05)。共培養(yǎng)12 h時(shí)VEGF mRNA 表達(dá)顯著增加，并持續(xù)至72 h(P<0.01)，VEGF蛋白表達(dá)在共培養(yǎng)12 h后顯著增高，24、48、72 h 時(shí)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論人膽管癌QBC939細(xì)胞可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加b-FGF分泌和VEGF表達(dá)。b-FGF和VEGF表達(dá)增加與腫瘤血管新生，以及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移可能具有相關(guān)性。

膽管腫瘤；內(nèi)皮細(xì)胞；臍靜脈；血管內(nèi)皮生長因子A

膽管癌是來源于肝內(nèi)或肝外膽管上皮的惡性腫瘤，早期臨床癥狀不典型，易向周圍組織、血管和神經(jīng)浸潤[1]。腫瘤內(nèi)部血管生成對(duì)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移具有重要作用，腫瘤血管的生成涉及多種促血管生成因子，其中堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-Fibroblast growth factor,b-FGF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是最強(qiáng)有力的血管生成因子。研究表明腫瘤細(xì)胞與正常內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系能夠在體外有效誘導(dǎo)正常內(nèi)皮細(xì)胞的瘤化發(fā)展及血管新生。本研究通過建立體外膽管癌細(xì)胞QBC939和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)共培養(yǎng)體系，觀察共培養(yǎng)時(shí)HUVEC細(xì)胞增殖，以及b-FGF分泌和VEGF表達(dá)的變化，探討膽管癌細(xì)胞對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人膽管癌細(xì)胞株QBC939由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院王曙光教授惠贈(zèng)；HUVEC購于武漢大學(xué)典型物種保存中心。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、雙抗(penicillin/streptomycin)、0.25%胰蛋白酶購于HyClone公司；TRIzol試劑(R0016)、CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；人VEGF抗體(AB52916)購于Abcam公司，免疫印跡試劑盒(KC-5G5)購于康成生物公司；一步法實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(DRR086A)購自TAKARA公司；ELISA試劑盒(DFB50)購于R&D公司。美國Thermo 3111二氧化碳孵箱、日本Olympus CKX41-A32PH倒置顯微鏡，美國Thermo Multiskan GO全自動(dòng)酶標(biāo)儀、美國UVP BioSpectrum410化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、美國BIO-RAD CFX96型實(shí)時(shí)定量PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞共培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長期的QBC939細(xì)胞置于24孔Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)下室，HUVEC加入共培養(yǎng)系統(tǒng)上室，QBC939細(xì)胞和HUVCE在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基共培養(yǎng)，細(xì)胞初始濃度比為2∶1。同時(shí)另外單獨(dú)培養(yǎng)QBC939和HUVEC細(xì)胞于共培養(yǎng)系統(tǒng)的下室和上室，上、下室為相同培養(yǎng)基。以共培養(yǎng)0 h為對(duì)照組，共培養(yǎng)12、24、48和72 h時(shí)，分別檢測培養(yǎng)上清液b-FGF的分泌，各組HUVEC細(xì)胞增殖，以及VEGF mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.2.2 CCK-8比色法檢測HUVEC增殖 取HUVEC按1×103加入96孔Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)的上室，QBC939 細(xì)胞接種于共培養(yǎng)系統(tǒng)的下室，QBC939細(xì)胞和HUVEC共培養(yǎng)細(xì)胞濃度比例為2∶1，同時(shí)按相同濃度接種HUVEC單獨(dú)培養(yǎng)于上室，每孔加入DMEM培養(yǎng)液100 μL，CCK-8 10 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別共培養(yǎng)0 h和12、24、48、72 h，酶標(biāo)儀上選定450 nm為測定波長，630 nm為參考波長，檢測每孔光密度值(OD值)，以共培養(yǎng)各時(shí)相OD值減去相應(yīng)單獨(dú)培養(yǎng)HUVEC的OD值，得出共培養(yǎng)QBC939對(duì)HUVEC增值的影響。

1.2.3 ELISA檢測共培養(yǎng)上清液中b-FGF 取100 μL收集的上清液，檢測步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，顯色后酶標(biāo)儀450 nm測OD值，共培養(yǎng)各時(shí)相OD值減去相應(yīng)單獨(dú)培養(yǎng)QBC939和HUVCE各組的OD值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出b-FGF含量。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測VEGF-mRNA VEGF擴(kuò)增引物(540 bp)：上游5′-GGA GTA CCC TGA TGA GAT CGA G-3′；下游5′-CAT TTG TTG TGC TGT AGG AAG C-3′。內(nèi)參GAPDH 擴(kuò)增引物(715bp)：上游5′-CAA ATT CCA TGG CAC CGT CA-3′；下游5′-GGA GTG GGT GTC GCT GTT GA-3′均由上海生物工程有限公司合成。Trizol法提取RNA，取40 ng RNA行qRT-PCR擴(kuò)增，步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。共培養(yǎng)各時(shí)相mRNA的相對(duì)表達(dá)量減去相應(yīng)單獨(dú)培養(yǎng)HUVEC各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量，得出共培養(yǎng)QBC939對(duì)HUVEC VEGF-mRNA 表達(dá)的影響。

1.2.5 Western blot檢測VEGF蛋白表達(dá) 常規(guī)提取蛋白質(zhì)，BCA法定量，取50 μg樣品加入5×SDS-PAGE樣品緩沖液，沸水煮5 min，行SDS-PAGE蛋白電泳，內(nèi)參為GAPDH。其后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，按免疫印跡試劑盒說明書操作，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測VEGF表達(dá)量。共培養(yǎng)各時(shí)相蛋白的相對(duì)表達(dá)量減去相應(yīng)單獨(dú)培養(yǎng)HUVEC各組蛋白相對(duì)表達(dá)量，得出共培養(yǎng)QBC939對(duì)HUVEC細(xì)胞VEGF 蛋白表達(dá)的影響。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8法檢測QBC939和HUVEC共培養(yǎng)對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 共培養(yǎng)12、24、48 h和72 h時(shí)，HUVEC增殖較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)。共培養(yǎng)72 h HUVEC細(xì)胞增殖能力較12 h顯著增加(P<0.01)，和24、48 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 共培養(yǎng)不同時(shí)間b-FGF的分泌變化 共培養(yǎng)0、12、24、48、72 h，b-FGF分別為0.665 3±0.070 8、0.814 8±0.061 7、0.806 6±0.063 1、0.800 2±0.034 3、0.700 4±0.092 5。與0 h組比較，共培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)HUVEC細(xì)胞b-FGF顯著增加(P<0.05)；72 h時(shí)b-FGF較0 h有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 共培養(yǎng)不同時(shí)間HUVEC的VEGF mRNA及蛋白表達(dá)變化 共培養(yǎng)0、12、24、48、72 h，VEGF mRNA分別為1.000 0±0.177 6、1.258 6±0.086 9、1.492 2±0.124 7、1.611 2±0.079 9、1.719 5±0.099 3。共培養(yǎng)12 h時(shí)HUVEC的VEGF mRNA表達(dá)升高，持續(xù)至72 h(P<0.01)；共培養(yǎng)72 h和12、24 h比較顯著增高(P<0.01)，和48 h比較有所增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。VEGF蛋白表達(dá)在共培養(yǎng)12 h時(shí)亦顯著升高，持續(xù)至72 h(P<0.01)；共培養(yǎng)72 h較12 h時(shí)顯著增高(P<0.01)，和24、48 h比較有所增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

*：P<0.01,與共培養(yǎng)0 h組比較；#：P<0.01，與共培養(yǎng)72 h組比較。1:共培養(yǎng)0 h組；2:共培養(yǎng)12 h組;3：共培養(yǎng)24 h組;4:共培養(yǎng)48 h組;5:共培養(yǎng)72 h組。

圖1 共培養(yǎng)不同時(shí)間HUVEC的VEGF蛋白表達(dá)

3 討 論

腫瘤微環(huán)境中各類細(xì)胞相互接觸、相互依存、相互作用，共同維持著腫瘤的各種特性。血管新生是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要病理基礎(chǔ)和條件[2-3]。腫瘤細(xì)胞和周邊宿主細(xì)胞分泌表達(dá)多種細(xì)胞因子，這些因子所形成的微環(huán)境有利于新生血管的生成，其中b-FGF和VEGF是最重要的血管生成因子，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有高度特異性。研究顯示[4-6]，腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)液可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加黏附力和侵襲力，促進(jìn)血管形成。本研究采用共培養(yǎng)方式，觀察膽管癌細(xì)胞株QBC939對(duì)HUVEC增殖及促血管生成因子分泌的影響，結(jié)果表明體外共培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞和HUVEC，可促進(jìn)HUVEC的增殖及b-FGF分泌與VEGF的表達(dá)增加。

b-FGF是FGF家族中的重要成員，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞萌芽、增殖，增加血管通透性，促進(jìn)血管新生[7]。有研究[8]證實(shí)，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是b-FGF和VEGF共同信號(hào)通路中的一個(gè)重要信號(hào)蛋白，通過激活MAPK可促使內(nèi)皮細(xì)胞間的連接和增殖。早在1998年，Seghezzi等[9]就提出b-FGF主要通過細(xì)胞的自分泌機(jī)制上調(diào)VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，b-FGF可通過刺激VEGF的表達(dá)及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用激活血管新生[10]。bFGF通過與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合而發(fā)生作用，因此細(xì)胞內(nèi)合成的b-FGF須分泌到細(xì)胞外才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，b-FGF的分泌在共培養(yǎng)12 h即顯著升高，24、48 h亦顯著高于對(duì)照組；VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)在共培養(yǎng)各時(shí)相點(diǎn)均較對(duì)照組顯著升高。VEGF 能特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，同時(shí)增加血管通透性，使血管內(nèi)成分滲漏，為血管內(nèi)皮的遷移及血管形成提供基質(zhì)。本研究共培養(yǎng)72 h時(shí)，HUVEC增殖雖顯著高于對(duì)照組和12 h組，但較24、48 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；共培養(yǎng)72 h時(shí)，b-FGF分泌較對(duì)照組差異不顯著，而VEGF的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，推測可能與共培養(yǎng)72 h時(shí)HUVEC增殖減緩及細(xì)胞分泌b-FGF能力降低有關(guān)。此外，VEGF的表達(dá)還可能受到其他因子的調(diào)控[11-12]。

本研究表明，膽管癌細(xì)胞能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，以及b-FGF分泌和VEGF表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的能力，為腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供條件和環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為膽管癌治療中抗血管生成積累資料，在此基礎(chǔ)上，有待進(jìn)一步研究其機(jī)制。

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Influence of cholangiocarcinoma cell lines on expression of b-FGF and VEGF in HUVEC in a co-culture system*

LiWei,YangYun,SongFuqiang,FengYaxing,LiKun△

(CenterofLaboratoryMedicine,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu,Sichuan610083,China)

Objective To study the influence of cholangiocarcinoma cell lines on the expression of b-FGF and VEGF in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) in a co-culture system.Methods A co-culture system of cholangiocarcinoma cell lines QBC939 and HUVEC were established in vitro.QBC939 cells and HUVCE were co-cultured for 12,24,48 and 72 h respectively,the proliferation of HUVEC was detected by CCK-8 assay.The b-FGF level in cell culture supernatant was detected by ELISA assay.The mRNA and protein expression levels of VEGF were detected by qRT-PCR and Western blot analysis.Results The proliferation of HUVEC was significantly increased at 12,24,48 and 72 h after incubation in a co-culture system (P<0.01).The mRNA expression level of VEGF in HUVEC was gradually increased after 12 h incubation with a time-dependent manner.It showed that the protein level of b-FGF and VEGF was also significantly increased at 12,24,48 h after incubation as compared to the control(P<0.05).Conclusion Human cholangiocarcinoma cells can promote the proliferation of endothelial cells,increase the secretion of b-FGF and upregulate the expression of VEGF,suggesting that the expressions of b-FGF and VEGF may be correlated with the tumor angiogenesis.

bile duct neoplasms;endothelial cells;umbilical veins;vascular endothelial growth factor A

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.13.008

四川省衛(wèi)生廳科學(xué)研究項(xiàng)目(100091)。

李薇(1986-)，碩士，主管技師，主要從事細(xì)胞生物學(xué)方面的研究。

△通訊作者，E-mail:kunli2005@sina.com。

R575.7

A

1671-8348(2015)13-1749-03

2014-10-28

2015-01-13)