干預(yù)Hedgehog信號(hào)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響

陸紅，吳蓮鳳，林成成，王斯璐，梁勇，白永恒

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1．醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心；2．外科實(shí)驗(yàn)室）

Hedgehog（HH）信號(hào)最早是在研究果蠅基因突變中被發(fā)現(xiàn)，主要由配體sonic hedgehog（Shh）、膜受體Patched 1（Ptch1）、信號(hào)開(kāi)關(guān)蛋白Smoothened（Smo）及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli1組成[1]。在整個(gè)信號(hào)通路中，Shh、Smo及Gli1為正調(diào)節(jié)作用，而Ptch1則起著負(fù)調(diào)節(jié)作用。最近有研究報(bào)道，持續(xù)異常激活的HH信號(hào)可導(dǎo)致胰腺癌、器官纖維化等多種增殖性疾病的發(fā)生[2-3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HH信號(hào)參與了腎間質(zhì)纖維化過(guò)程，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化和基質(zhì)累積[4-5]，然而，其機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究擬通過(guò)外源性重組蛋白Shh來(lái)活化HH信號(hào)，以及環(huán)杷明特異性阻斷HH信號(hào)的活化，檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達(dá)改變，旨在從體外實(shí)驗(yàn)角度觀察調(diào)控HH信號(hào)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶和TRIzol提取液（美國(guó)Gibco公司）；兔抗鼠Ptch1、Smo、Gli1和PCNA單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；RT-PCR試劑（美國(guó)Promega公司）；重組蛋白Shh和環(huán)杷明（美國(guó)PeproTech公司）；MyCycler梯度PCR儀（美國(guó)Bio-Rod公司）；7500定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystens公司）；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能掃描儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠腎小管上皮細(xì)胞系（NRK-52E）購(gòu)于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞培養(yǎng)條件為5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)前，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)密度并鋪板于六孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度為50%～70%時(shí)，開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。設(shè)立組別：對(duì)照組：不加入Shh和環(huán)杷明；活化組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10μg/L Shh；干預(yù)組：在10μg/L Shh基礎(chǔ)上，加入5μmol/L環(huán)杷明。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 real-time RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：采用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)RT-PCR試劑說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對(duì)Ptch1和Smo mRNA設(shè)計(jì)特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參，采用real-time RT-PCR相對(duì)定量法進(jìn)行檢測(cè)。引物序列如表1所示，由上海捷瑞公司合成。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL進(jìn)行定量PCR，PCR擴(kuò)增體系：5μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、上下游引物各1μL，終濃度為200 nmol/L、1μL cDNA、2μL反應(yīng)緩沖液。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。通過(guò)熔解曲線評(píng)價(jià)PCR結(jié)果可靠性，采用2-△△Ct計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)量?！鳌鰿t=[Ct目的基因（待測(cè)樣品）-Ct內(nèi)參（待測(cè)樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct內(nèi)參（校正樣品）]。

表1 擴(kuò)增Ptch1和Smo mRNA特異性引物

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)HH信號(hào)和PCNA蛋白表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NRK-52E細(xì)胞，分別加入溶劑，10μg/L Shh和10μg/L Shh基礎(chǔ)上加入5μmol/L環(huán)杷明進(jìn)行爬片培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，4%甲醛固定，用含0.03% Triton X-100的PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜。5%二抗血清封閉孵育，行一抗孵育與二抗孵育，用DAPI進(jìn)行核染，封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察并圖像獲取Ptch1、Smo、Gli1和PCNA的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以 ±s表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)和精確概率法，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白Shh及環(huán)杷明對(duì)HH信號(hào)的影響 細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞中Ptch1表達(dá)較高，Smo和Gli1表達(dá)較低，提示HH信號(hào)活性較低。應(yīng)用10μg/L Shh作用NRK-52E細(xì)胞24 h后，Ptch1蛋白表達(dá)顯著下降，而Smo和Gli1蛋白表達(dá)顯著升高，見(jiàn)圖1。Real-time RT-PCR結(jié)果也顯示，Ptch1 mRNA表達(dá)下降，Smo mRNA表達(dá)升高（見(jiàn)表2）。這些結(jié)果提示HH信號(hào)通路被Shh活化。用環(huán)杷明進(jìn)行干預(yù)后，Ptch1表達(dá)升高，Smo和Gli1表達(dá)下調(diào)（見(jiàn)圖2）。此外，Ptch1 mRNA表達(dá)量也顯著上調(diào)，而Smo mRNA表達(dá)下調(diào)（見(jiàn)表2）。因此，Shh誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞中HH信號(hào)的活化，可被環(huán)杷明所阻滯。

2.2 重組蛋白Shh及環(huán)杷明對(duì)PCNA表達(dá)的影響PCNA作為細(xì)胞增殖最重要的標(biāo)志物之一，主要定位表達(dá)于細(xì)胞核中。對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞中PCNA的表達(dá)水平較低（見(jiàn)圖2a和2a’），而活化組細(xì)胞表達(dá)PCNA蛋白的水平明顯上調(diào)（見(jiàn)圖2b和2b’）。此結(jié)果提示，Shh活化HH信號(hào)后，可引起細(xì)胞增殖性反應(yīng)。加入環(huán)杷明后，抑制了由Shh所致的PCNA高表達(dá)（見(jiàn)圖2c和2c’）。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，原本核染位置的PCNA也游離到胞漿之外，這提示環(huán)杷明可誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死等形態(tài)學(xué)改變。

圖1 重組蛋白Shh及環(huán)杷明對(duì)HH信號(hào)的影響（×400）

圖2 活化和阻斷HH信號(hào)對(duì)NRK-52E細(xì)胞PCNA的影響（×400）

2.3 活化和抑制HH信號(hào)對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖的影響倒置相差顯微鏡下，正常的腎小管上皮細(xì)胞相互重疊生長(zhǎng)，呈鋪路石狀；當(dāng)重組蛋白Shh作用后，腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量增加的同時(shí)細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，且細(xì)胞邊界明顯；而當(dāng)環(huán)杷明對(duì)活化組進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞變大，細(xì)胞數(shù)量減少且間隙變寬，細(xì)胞間甚至形成空洞，見(jiàn)圖3。這些結(jié)果提示活化HH信號(hào)對(duì)細(xì)胞增殖的影響不僅僅是細(xì)胞數(shù)目的增加，而且細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生改變，如表型轉(zhuǎn)化。

表2 各組間Ptch1和Smo mRNA表達(dá)量的比較（n=6， ±s）

3 討論

HH信號(hào)是一條高度保守的信號(hào)通路，在哺乳動(dòng)物中，HH信號(hào)通路對(duì)于器官發(fā)育、維持成熟組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、慢性炎癥中的組織修復(fù)和癌癥發(fā)生等多種進(jìn)程發(fā)揮著十分重要的作用[6]。

圖3 活化和阻斷HH信號(hào)對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖的影響（×400）

國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，在梗阻性膽管疾病中，HH信號(hào)可被活化，進(jìn)而促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致膽管組織纖維化的發(fā)生[3]。我們前期研究也顯示，HH信號(hào)參與了腎間質(zhì)纖維化過(guò)程[4-5]。在體外，馬兜鈴酸可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)和釋放TGF-β1，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致基質(zhì)成分I和III型膠原的過(guò)度累積[4]。在體內(nèi)，輸尿管梗阻引起了腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致間質(zhì)纖維化的發(fā)生[5]。在這些過(guò)程中，HH信號(hào)均被激活[7]。然而，HH信號(hào)如何調(diào)控小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，其分子機(jī)制尚不十分清楚。Mill等[8]研究顯示，活化的HH信號(hào)能夠上調(diào)其轉(zhuǎn)錄靶蛋白Cyclin E和Cyclin D的表達(dá)，后兩者加快細(xì)胞G/S期的轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度增殖和表型轉(zhuǎn)化。本研究中，我們通過(guò)人為誘導(dǎo)HH信號(hào)的活化，發(fā)現(xiàn)PCNA表達(dá)顯著增加。PCNA為細(xì)胞增殖信號(hào)相對(duì)較下游的標(biāo)志物，其表達(dá)水平提高，意味著細(xì)胞過(guò)度增殖。這種增殖不僅表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞數(shù)目的增加，而且細(xì)胞形態(tài)上也發(fā)生了改變。我們推測(cè)，在損傷微環(huán)境中，多種因素可誘導(dǎo)HH信號(hào)的活化。活化的HH信號(hào)誘導(dǎo)自身或周?chē)纳掀ぜ?xì)胞不僅通過(guò)正常增殖維持一定的細(xì)胞數(shù)量，而且也通過(guò)異常增殖方式，轉(zhuǎn)化為耐受力更強(qiáng)的肌成纖維細(xì)胞以維持生存[9]。這種增殖方式也就是由所謂的表型轉(zhuǎn)化而形成的肌成纖維細(xì)胞能分泌膠原成分在局部累積導(dǎo)致纖維化。

環(huán)杷明是一種從藜蘆屬植物內(nèi)分離得到的異甾體類(lèi)生物堿。環(huán)杷明可通過(guò)特異性改變Smo空間構(gòu)象，抑制其活性，從而抑制HH信號(hào)通路[10]。此外，環(huán)杷明與Smo結(jié)合能夠使細(xì)胞的分裂停止于G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。本研究也證實(shí)了活化的HH信號(hào)可被環(huán)杷明所抑制，并且PCNA的表達(dá)也明顯下調(diào)。下調(diào)的PCNA與小管上皮細(xì)胞增殖的抑制密切相關(guān)，這結(jié)果也從形態(tài)學(xué)角度得到驗(yàn)證。鏡下我們觀察到，環(huán)杷明抑制了細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡壞死。

綜上所述，通過(guò)干預(yù)HH信號(hào)，可以調(diào)控PCNA的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖效應(yīng)。然而，這種不僅增加細(xì)胞數(shù)目，而且也誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的增殖性調(diào)控機(jī)制還需今后的研究加以論證。

[1] Yauch RL, Gould SE, Scales SJ, et al. A paracrine requirement for hedgehog signalling in cancer[J]. Nature,2008, 455(7211): 406-410.

[2] Onishi H, Katano M. Hedgehog signaling pathway as a new therapeutic target in pancreatic cancer[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(9): 2335-2342.

[3] Omenetti A, Porrello A, Jung Y, et al. Hedgehog signaling regulates epithelial-mesenchymal transition during biliary fi brosis in rodents and humans[J]. J Clin Invest, 2008, 118(10): 3331-3342.

[4] 白永恒, 洪煒龍, 劉彪, 等. Sonic Hedgehog信號(hào)參與馬兜鈴酸損傷腎小管上皮細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華腎臟病雜志, 2013, 29(4): 288-292.

[5] 白永恒, 陸紅, 周琴, 等. Sonic Hedgehog信號(hào)通路在單側(cè)輸尿管梗大鼠腎組織中的表達(dá)變化及意義[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2012, 28(12): 2227-2232.

[6] Katoh Y, Katoh M. Hedgehog signaling pathway and gastrointestinal stem cell signaling network[J]. Int J Mol Med,2006, 18(6): 1019-1023.

[7] Ding H, Zhou D, Hao S, et al. Sonic hedgehog signaling mediates epithelial-mesenchymal communication and promotes renal fi brosis[J]. J Am Soc Nephrol, 2012, 23(5): 801-813.

[8] Mill P, Mo R, Fu H, et al. Sonic hedgehog-dependent activation of Gli2 is essential for embryonic hair follicle Development[J]. Genes Dev, 2003, 17(2): 282-294.

[9] 胡麗萍, 陸紅, 白永恒, 等. 小G蛋白R(shí)ac1在馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用及意義[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 43(12): 775-778.

[10] Tremblay MR, Nevalainen M, Nair SJ, et al. Semisynthetic cyclopamine analogues as potent and orally bioavailable hedgehog pathway antagonists[J]. J Med Chem, 2008, 51(21): 6646-6649.