外源性激素對(duì)異種移植后人胎卵巢組織的影響

童月紅，周穎，吳丹丹，傅曉艷

（1.金華市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 金華 321000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江溫州 325000；3.金華市職業(yè)技術(shù)學(xué)院 解剖學(xué)教研室，浙江 金華 321000）

卵巢組織冷凍移植技術(shù)的發(fā)展為保存女性的生殖及內(nèi)分泌功能提供了可能。但卵巢組織的來源極為有限，無法滿足如卵巢早衰等患者的自體卵巢組織冷凍移植的需求。凍融人胎卵巢組織進(jìn)行移植可成為解決這一問題的有效途徑，但將其應(yīng)用于臨床尚需大量的實(shí)驗(yàn)研究。本研究以裸鼠異體移植作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，比較不同的外源性促性腺激素作用方式對(duì)凍融人胎卵巢組織異種移植后卵泡發(fā)育的影響，為其將來作為移植供體的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)收集引產(chǎn)的女性胚胎卵巢（由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分娩室提供，并與家屬簽署知情同意書）6例，胎齡為28～35周。本實(shí)驗(yàn)選用雌性裸鼠（BACLB/CA/nu-nu，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）54只，6～8周齡，體質(zhì)量17～23 g，平均（20±3.15）g，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按不同外源性促性腺激素給予方式（A、B、C）及不同時(shí)期（分別為10～14周、18～22周、26～30周）回收移植物分為9組，每組6只，共54只。

1.2 主要試劑 Leibovitz-15（購(gòu)自Sigma公司），丙二醇（PROH）（購(gòu)自Sigma公司），孕馬血清促性腺激素（PMSG）（購(gòu)自寧波第二激素廠），人絨毛膜促性腺激素（hCG）（購(gòu)自麗珠集團(tuán)），Bolin固定液、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）試劑盒（由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）。

1.3 方法

1.3.1 人胎卵巢組織的凍融：獲取的卵巢組織室溫下Leiboviz-15基礎(chǔ)培養(yǎng)液中切成約2 mm×3 mm×3 mm小塊，組織立即于Bolin液中固定為新鮮組。其余組織塊置于含1.5 mL PROH冷凍保護(hù)液的冷凍管中，采用Oktay等[1]提出的慢速冷凍快速?gòu)?fù)溫法操作，解凍后組織塊于Bolin液中固定為凍融組，其余組織切成約1 mm3大小用于移植，為移植組。

1.3.2 去勢(shì)及移植手術(shù)：腹腔麻醉后，去除裸鼠雙側(cè)卵巢，暴露腎臟，分別于雙側(cè)腎被膜下各移入1塊組織。凍融人胎卵巢組織異種移植后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組（每組各18只），A組：移植術(shù)后4周開始每只隔日PMSG 5 IU經(jīng)腹腔注射至取材；B組：取材前14 d開始每只隔日經(jīng)腹腔注射PMSG 5 IU，直至取材，共7次；C組：移植術(shù)后4周開始等量0.9%氯化鈉溶液隔日經(jīng)腹腔注射至取材。分別于術(shù)后10～14周、18～22周、26～30周回收移植物，取材前36 h腹腔注射hCG 5 IU，回收的移植物立即置于Bolin溶液中固定。

1.3.3 卵泡計(jì)數(shù)：新鮮和移植后取回的卵巢組織固定Bolin液中作石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5μm，用蘇木素-伊紅染色。按Gougeon[2]卵泡分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)：?jiǎn)螌颖馄交虮馄脚c立方混合的前顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞為原始卵泡；單層立方形顆粒細(xì)胞包繞中間的卵母細(xì)胞為初級(jí)卵泡；兩層或以上立方形顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞，無竇腔形成為次級(jí)卵泡；兩層以上的顆粒細(xì)胞，卵泡內(nèi)有竇腔形成為竇卵泡。原始卵泡：高倍鏡400倍下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每隔10張切片中的卵泡數(shù)。初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡及竇卵泡：分別計(jì)數(shù)所有切片中各階段卵泡總數(shù)。1.3.4 PCNA免疫組織化學(xué)分析：移植后回收的卵巢組織常規(guī)固定包埋，5μm連續(xù)切片，每隔10張切片取一張，按試劑盒說明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，蘇木素復(fù)染。結(jié)果判斷：PCNA定位于細(xì)胞核內(nèi)，陽性呈棕褐色，陰性呈藍(lán)色。每張切片在400倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野100個(gè)以上陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性指數(shù)（陽性指數(shù)=視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。新鮮組和凍融組卵巢組織內(nèi)卵泡計(jì)數(shù)以 ±s表示，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，各移植組間卵泡計(jì)數(shù)及PCNA陽性指數(shù)則采用多組等級(jí)資料的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再進(jìn)一步進(jìn)行3組樣本秩和的兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新鮮組和凍融組人胎卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

新鮮組及凍融組人胎卵巢組織中的卵泡均以原始卵泡為主，分布較均勻，絕大部分形態(tài)正常，部分原始卵泡的卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)有空泡形成，可見卵原細(xì)胞散在分布，未見初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡及竇卵泡。凍融組的原始卵泡數(shù)量為（30.10±9.44）個(gè)，比新鮮組的（37.26±8.91）個(gè)少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 移植組的檢測(cè)

2.2.1 移植物的存活：整個(gè)實(shí)驗(yàn)中無動(dòng)物死亡。取材時(shí)可見腎被膜下移植物凸出腎臟表面，體積不同程度增大，呈亮白色，部分可見透明竇狀小泡（見圖1）。A、B、C各組移植物回收率分別為88.9%（32/36）、86.1%（31/36）、88.9%（32/36），存活率分別為75.0%（27/36）、77.8%（28/36）、75.0%（27/36），3組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.2 卵泡計(jì)數(shù)：3組移植物中的原始卵泡數(shù)與新鮮組及凍融組相比均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組移植物隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng)，卵泡呈現(xiàn)原始卵泡數(shù)目減少及生長(zhǎng)卵泡增加趨勢(shì)。A組：與10～14周相比，26～30周移植物中的原始卵泡數(shù)減少而次級(jí)卵泡數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組：各時(shí)期原始卵泡數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與10～14周及18～22周相比，26～30周移植物中的初級(jí)卵泡數(shù)及次級(jí)卵泡數(shù)均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組：各時(shí)期移植物中原始卵泡數(shù)及次級(jí)卵泡數(shù)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與10～14周相比，18～22周及26～30周移植物中的初級(jí)卵泡數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

移植早期（10～14周）：A、B、C 3組均可觀察到初級(jí)卵泡（見圖2）及次級(jí)卵泡（見圖3）。移植中期（18～22周）：與移植早期相比，3組移植物中的原始卵泡數(shù)、初級(jí)卵泡數(shù)及次級(jí)卵泡數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A、B 2組各觀察到2個(gè)和1個(gè)竇卵泡（見圖1-4）。移植晚期（26～30周）：同期B、C組移植物中的原始卵泡數(shù)較A組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3組移植物中的初級(jí)卵泡數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同期A、B組移植物中的次級(jí)卵泡數(shù)較C組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且此期A、B、C 3組分別可見1個(gè)、2個(gè)、1個(gè)竇卵泡。各組各期原始卵泡計(jì)數(shù)具體見表1，初級(jí)卵泡計(jì)數(shù)見表2，次級(jí)卵泡計(jì)數(shù)見表3。

2.2.3 PCNA的免疫組織化學(xué)檢測(cè)：3組的移植物中呈棕褐色的陽性細(xì)胞主要表達(dá)于初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞及卵細(xì)胞核內(nèi)；組織間質(zhì)中也可見較多陽性表達(dá)細(xì)胞存在；偶見原始卵泡中體積增大、呈立方形的前顆粒細(xì)胞呈陽性表達(dá)（見圖5-6）。定位陽性表達(dá)細(xì)胞于初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞及卵細(xì)胞核，A、B、C 3組移植物PCNA陽性指數(shù)分別為55%～88%、52%～85%、46%～80%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

在卵巢組織的冷凍研究中，采用冷凍劑PROH及程序化冷凍法[3-4]，可獲得較為穩(wěn)定的效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)凍融后人胎卵巢組織中仍存大量的原始卵泡，移植后卵泡的生長(zhǎng)及PCNA的良好表達(dá)也進(jìn)一步證實(shí)組織功能的完整性。但本研究結(jié)果示人胎卵巢組織移植后喪失的原始卵泡達(dá)50%以上，與成年[5]及青春前期[6]的人卵巢組織相比有差距，如何提高移植后組織內(nèi)的卵泡的數(shù)量我們將繼續(xù)研究。

表1 各組不同時(shí)期回收移植物中的原始卵泡數(shù)計(jì)數(shù)（ ±s，個(gè)）

表2 各組不同時(shí)期回收移植物中的初級(jí)卵泡計(jì)數(shù)（ ±s，個(gè)）

表3 各組不同時(shí)期回收移植物中的次級(jí)卵泡計(jì)數(shù)（ ±s，個(gè)）

圖1 回收的人胎卵巢組織（T示移植物，其中可見竇卵泡，K示裸鼠腎臟）

圖4 術(shù)后22周回收移植物內(nèi)可見竇卵泡發(fā)育（HE，×200）

圖2 術(shù)后10周回收移植物內(nèi)可見初級(jí)卵泡（HE，×400）

圖5 A組18周回收移植物的PCNA染色（×400）

圖3 術(shù)后14周回收移植物內(nèi)可見次級(jí)卵泡（HE，×400）

圖6 C組18周回收移植物的PCNA染色（×400）

人胎卵巢組織中存在的大量原始卵泡，且組織中所含較低的人類器官移植相關(guān)的抗原及較高的血管源性和神經(jīng)源性因子，適用于異體移植。目前人胎卵巢研究的重要問題是促進(jìn)更多數(shù)量卵泡的成熟發(fā)育及延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間。移植物的激素環(huán)境是影響卵泡發(fā)育的重要因素。既往關(guān)于外源性促性腺激素方案與異體移植后卵巢組織內(nèi)卵泡發(fā)育的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在矛盾，因研究物種及選擇激素作用方式的不同相關(guān)。Pisani等[7]在以SCID鼠為模型的豬卵巢同種異體移植實(shí)驗(yàn)中，持續(xù)作用的外源性促性腺激素對(duì)卵泡的發(fā)育并沒有顯示出顯著作用；Gook等[8]卵巢異種移植中卻顯示外源性促性腺激素可促進(jìn)組織中更多卵泡發(fā)育。為探索外源性促性腺激素對(duì)人胎卵巢組織異種移植的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩種不同的激素作用方式，一種是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道所采用的外源性促性腺激素持續(xù)作用方式（即A組采用的方式），另一種是試圖模擬成人促排卵激素作用方式（即B組采用的方式）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，即使缺乏外源性促性腺激素作用，卵泡仍能發(fā)育至竇卵泡階段；不管何種作用方式，外源性促性腺激素對(duì)異種移植后人胎卵巢組織中卵泡生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，不同于Pisani等[7]研究，與Gook等[8]結(jié)果類似，且外源性激素對(duì)初級(jí)卵泡以上的卵泡生長(zhǎng)促進(jìn)作用更為顯著。推測(cè)原因?yàn)楫惙N移植的人胎卵巢組織中大部分為原始卵泡，該階段卵泡需經(jīng)非激素依賴生長(zhǎng)啟動(dòng)階段，外源性促性腺激素持續(xù)作用主要作用于卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng)后階段，對(duì)兩層顆粒細(xì)胞以上的卵泡起關(guān)鍵作用，故在卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng)前階段其促生長(zhǎng)作用是有限的。但本實(shí)驗(yàn)觀察到，人胎卵巢組織長(zhǎng)期移植后存在一定數(shù)量的生長(zhǎng)啟動(dòng)卵泡及初級(jí)卵泡，由于外源性促性腺激素持續(xù)作用和促排卵激素作用方式都主要作用于此類卵泡，故二者均獲得較好的卵泡發(fā)育結(jié)果。由于部分學(xué)者[9]認(rèn)為外源性激素在卵巢移植過程中發(fā)揮促進(jìn)顆粒細(xì)胞的有絲分裂及抑制凋亡的作用，同時(shí)對(duì)卵巢間質(zhì)細(xì)胞分化起作用[10]，因此盡管外源性促性腺激素持續(xù)作用與促排卵激素作用方式?jīng)]有差別，所以有學(xué)者仍建議長(zhǎng)期采用該方式。但本實(shí)驗(yàn)中兩種激素作用方式下的PCNA陽性差異也不明顯。又有學(xué)者[11]提出，外源性促性腺激素的長(zhǎng)期使用會(huì)大量消耗移植組織內(nèi)原始卵泡儲(chǔ)備，造成移植物維持時(shí)間的縮短。本實(shí)驗(yàn)還觀察到，移植后期外源性促性腺激素持續(xù)作用后組織中的原始卵泡數(shù)下降，而促排卵激素作用方式下的組織中原始卵泡數(shù)變化相對(duì)不明顯。故雖兩種激素作用者均可獲得較好的卵泡發(fā)育結(jié)果，但促排卵激素作用方式對(duì)原始卵泡儲(chǔ)備造成的影響可能更小。

綜上所述，去勢(shì)的雌性裸鼠體內(nèi)的促性腺激素水平已達(dá)卵泡發(fā)育所需，外源性促性腺激素持續(xù)作用方式及促排卵激素用方式均可進(jìn)一步促進(jìn)異種移植后凍融人胎卵巢組織中卵泡的發(fā)育。但本實(shí)驗(yàn)最終均未見黃體組織，需考慮移植后組織中的竇卵泡是否存在成熟及排卵障礙，而不同的激素作用方式對(duì)卵子質(zhì)量[12]的影響等問題均需進(jìn)一步研究闡明。

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