兩性多肽結(jié)構(gòu)影響鮑曼不動桿菌外膜通透性的實驗研究

張 劼，陳 永，曾 穎△,李秀娟

(1.重慶市第三人民醫(yī)院老年病科 400014;2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院第一分院內(nèi)科 400015)

兩性多肽結(jié)構(gòu)影響鮑曼不動桿菌外膜通透性的實驗研究

張 劼1，陳 永1，曾 穎1△,李秀娟2

(1.重慶市第三人民醫(yī)院老年病科 400014;2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院第一分院內(nèi)科 400015)

目的 明確兩性多肽結(jié)構(gòu)對鮑曼不動桿菌(AB)外膜通透性的影響。方法PCR擴增LysAB3基因及刪除兩性多肽結(jié)構(gòu)的LysAB3-D基因，以pET28a(+)為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達LysAB3及LysAB3-D，金屬離子螯合親和層析法純化重組蛋白。將AB分別經(jīng)LysAB3及LysAB3-D處理后，用掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)，熒光顯微鏡觀察菌體中是否有綠色熒光的聚集。結(jié)果經(jīng)LysAB3處理后的AB，在掃描電子顯微鏡下可見菌體表面粗糙、皺縮，部分裂解為碎片；在熒光顯微鏡下可見菌體內(nèi)有綠色熒光聚集。而刪除兩性多肽結(jié)構(gòu)的LysAB3-D作用AB后，卻沒有上述現(xiàn)象的發(fā)生。結(jié)論兩性多肽結(jié)構(gòu)可增加AB外膜通透性，有助于裂解酶進入其中，達到抗菌目的。

噬菌體；裂解酶；兩性多肽結(jié)構(gòu)；鮑曼不動桿菌；外膜通透性

2010年中國CHINET細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)的數(shù)據(jù)表明，鮑曼不動桿菌(acinetobacter baumannii,AB)菌株臨床分離率已經(jīng)達到革蘭陰性菌總體分離率的第3位，其耐藥率急劇上升，甚至到了無藥可治的地步[1]。噬菌體是一類細菌依賴性病毒，能在菌體內(nèi)快速增殖并最終裂解細菌達到抗菌作用，但噬菌體往往只能裂解單一的細菌分離株，而不能裂解同一類細菌的其他分離株。來源于噬菌體的裂解酶則不需要特異性的識別過程，可裂解不同的細菌分離株，其裂菌譜相比噬菌體明顯增寬。當前裂解酶應用于革蘭陰性菌感染的研究很少，這是因為革蘭陰性菌外膜通透性低，限制了裂解酶進入其中裂解細菌[2]。但有研究指出[3]，部分裂解酶C端的兩性多肽結(jié)構(gòu)，可增加革蘭陰性菌外膜的通透性，形成細菌外膜孔道，有利于裂解酶進入其中裂解細菌。本文主要對上述觀點進行實驗驗證。

1 材料與方法

1.1菌株、噬菌體及試劑 AB菌株來自重慶巿臨床檢驗中心；噬菌體AB3由前期分離純化；正反向引物(上海生工生物工程公司)；Nco I、Xho I、dNTP、Kod plus DNA聚合酶、T4 DNA連接酶(大連寶生物工程公司)；咪唑、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-Thiogalacto pyranoside,IPTG)、卡那霉素、LB培養(yǎng)基、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)(美國Sigma公司)；Ni2+-NTA親和層析柱(美國GE公司)；pET28a(+)質(zhì)粒(美國Novagen公司)。

1.2LysAB3基因的表達及純化 將前期分離純化的噬菌體AB3 DNA作為模板，設(shè)計目的基因LysAB3的正反向引物，加入限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I的酶切位點。加入dNTP及Kod plus DNA聚合酶進行PCR反應，使用回收試劑盒分離純化PCR產(chǎn)物，使用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I分別酶切上述PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a(+)，加入T4 DNA連接酶行連接反應，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-LysAB3，篩選陽性克隆測定目的基因序列。將pET28a-LysAB3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，接種于LB培養(yǎng)液(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)至OD600=0.6，加IPTG誘導表達，離心收集菌體，超聲破碎4 ℃離心，上清液用Ni2+-NTA 親和層析柱分離純化，經(jīng)咪唑洗滌、洗脫后，收集重組蛋白，取樣檢測，將重組蛋白命名為LysAB3[4]。

1.3刪除兩性多肽結(jié)構(gòu)的LysAB3-D基因的表達及純化 將前期分離純化的噬菌體AB3 DNA作為模板，設(shè)計正反向引物，加入限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I的酶切位點。擴增LysAB3基因序列前端的354 bp，加入dNTP及Kodplus DNA聚合酶行PCR反應，使用回收試劑盒分離純化PCR產(chǎn)物，使用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I分別酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a(+)，T4 DNA連接酶進行連接反應，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-LysAB3-D，篩選出陽性克隆，檢測重組質(zhì)粒目的基因序列。將pET28a-LysAB3-D轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，接種于LB培養(yǎng)液(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)至OD600=0.6，加IPTG誘導表達，超聲破碎4 ℃離心，上清液用Ni2+-NTA親和層析柱分離純化，經(jīng)咪唑洗滌、洗脫后，收集重組蛋白，取樣檢測，將重組蛋白命名為LysAB3-D。

1.4掃描電子顯微鏡下觀察AB菌體形態(tài) AB分別與LysAB3、LysAB3-D各50 μg混合培養(yǎng)37 ℃ 30 min后，經(jīng)固定、脫水、干燥和真空鍍膜制樣后，掃描電子顯微鏡(Hitachi S-3 000 N)下觀察，并設(shè)陰性對照。

1.5AB外膜通透性檢測 采用FITC熒光染色的方法觀察AB外膜通透性的改變。按Mangoni等[5]所描述的方法，將AB于37 ℃的LB培養(yǎng)液振蕩過夜，直至OD600=0.6，之后將細菌離心、洗滌并重懸于PBS緩沖液中。將107細菌分別混合50 μg的LysAB3和LysAB3-D，用PBS稀釋至100 μL，設(shè)立陰性對照組。將上述混合物置于EP管37 ℃共育30 min后，傾倒于玻片上，37 ℃靜置30 min，保證AB附著于玻片上。用PBS液輕輕沖洗玻片后，滴加1 mL FITC溶液(6 μg/mL)。靜置30 min后，用PBS液輕輕沖洗玻片，去除未附著FITC。隨后分別用普通白光顯微鏡和熒光顯微鏡觀察玻片，了解綠色熒光探針FITC是否能進入菌體內(nèi)。

2 結(jié) 果

2.1LysAB3基因的表達及純化 擴增產(chǎn)物經(jīng)過Nco I和Xho I雙酶切后，得到pET28a-LysAB3載體，篩選陽性克隆抽提質(zhì)粒并測序，測序結(jié)果與GenBank KC311669中的裂解酶基因相同，構(gòu)建成功[6]。將pET28a-LysAB3轉(zhuǎn)化后，經(jīng)IPTG誘導表達，收集菌體超聲破碎，取上清液用Ni2+-NTA親和層析柱分離純化。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示重組蛋白與預期蛋白相對分子質(zhì)量21.07×103基本一致(圖1)。

圖1 LysAB3重組蛋白表達的SDS-PAGE分析

2.2刪除兩性多肽結(jié)構(gòu)的LysAB3-D基因的表達及純化 擴增產(chǎn)物經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切后，得到重組質(zhì)粒pET28a-LysAB3-D，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆抽提質(zhì)粒測序，比對后證明同源性100%。將pET28a-LysAB3-D轉(zhuǎn)化后誘導表達收集菌體超聲破碎，取上清液用Ni2+-NTA親和層析柱分離純化[7]。SDS-PAGE顯示重組蛋白與預期蛋白相對分子質(zhì)量14.6×103基本一致，將重組蛋白命名為LysAB3-D(圖2)。

圖2 LysAB3-D重組蛋白表達的SDS-PAGE分析

2.3掃描電子顯微鏡下觀察AB菌體形態(tài) 經(jīng)LysAB3處理后的AB菌體表面粗糙、皺縮、腫脹、碎片形成，原有形態(tài)改變(圖3A)；而LysAB3-D處理后及對照組的AB菌體表面光滑、形態(tài)規(guī)則，呈桿狀(圖3B、C)。表明LysAB3對AB有裂解活性，而刪除了兩性多肽結(jié)構(gòu)的LysAB3-D則喪失了抗菌作用，提示這種兩性多肽結(jié)構(gòu)在抗菌過程中可能起到重要作用。

A:LysAB3處理后；B:LysAB3-D處理后；C:陰性對照。

圖3 掃描電子顯微鏡下AB菌體形態(tài)(×10 000)

A:LysAB3-D處理后普通白光顯微鏡；B:LysAB3-D處理后熒光顯微鏡；C:LysAB3處理后普通白光顯微鏡；D:LysAB3處理后熒光顯微鏡。

圖4 熒光顯微鏡下細菌細胞外膜通透性的改變(×400)

2.4熒光顯微鏡下觀察AB外膜通透性 FITC是一種小分子量(389.4 Da)綠色熒光探針，不能通過細菌細胞膜。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC不能進入LysAB3-D(刪除兩性多肽結(jié)構(gòu))處理過的AB菌體，熒光顯微鏡不能在菌體中發(fā)現(xiàn)綠色熒光的聚集(圖4A、B)；但FITC卻能進入LysAB3處理過的AB菌體，通過熒光顯微鏡可見綠色熒光在菌體內(nèi)的聚集(圖4C、D)。提示裂解酶LysAB3的兩性多肽結(jié)構(gòu)可增加細菌外膜通透性，有助于FITC進入其中[8]。

3 討 論

噬菌體治療細菌感染時需要與宿主菌發(fā)生特異性吸附并注入其DNA，導致噬菌體抗菌譜的專一性太強，大大限制了噬菌體的應用[2]。而裂解酶是噬菌體基因組復制晚期合成的一種酶，它能降解細菌細胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)，從而裂解細菌菌體，是一種新型殺菌物質(zhì)。雖然裂解酶應用于革蘭陽性菌治療方面的研究較多，但應用于革蘭陰性菌感染方面的研究卻很少。其原因為革蘭陰性菌外膜的主要成分——脂多糖不允許大分子量物質(zhì)通過，僅允許小分子量疏水性物質(zhì)通過。

而噬菌體AB3來源的裂解酶LysAB3 C端(113～145 aa)聚集的氨基酸往往帶有較多正電荷，如賴氨酸、精氨酸，周圍還被疏水氨基酸所包繞，構(gòu)成了包含堿性氨基酸殘基的螺旋狀兩性多肽結(jié)構(gòu)。借助這種螺旋狀兩性多肽結(jié)構(gòu)，LysAB3的C端可明顯增加革蘭陰性菌外膜的通透性。究其原因可能與細菌外膜形成離子孔道有關(guān)，LysAB3的C端可競爭性地替代革蘭陰性菌外膜中，發(fā)揮連接作用的Mg2+或Ca2+，并中和脂多糖，破壞了細菌外膜的密閉性，增加了通透性[3]。LysAB3通過細菌外膜進入菌體后，可水解細胞壁肽聚糖共價鍵，破壞菌體的完整性、裂解細菌，達到抗菌治療目的。有研究指出，缺少C端的T4裂解酶，不能通過細菌外膜，提示裂解酶C端的兩性多肽結(jié)構(gòu)可能在增加細菌外膜通透性方面起到重要作用[9-10]。Lai等[3]構(gòu)建的裂解酶缺少兩性多肽結(jié)構(gòu)，僅保留了酶解催化區(qū)域，使裂解酶喪失了對細菌外膜的通透性，抗菌率下降至原水平的40%；若進一步去除酶解催化區(qū)域，抗菌率可進一步下降至原水平的20%，提示兩性多肽結(jié)構(gòu)在裂解酶殺菌過程中起到了重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)LysAB3處理后的AB，菌體部分裂解為碎片，殘存菌體表面粗糙、皺縮、腫脹，原有形態(tài)改變，而刪除兩性多肽結(jié)構(gòu)的LysAB3-D處理后的AB卻未見上述現(xiàn)象。另一方面，經(jīng)LysAB3處理后的AB外膜通透性增加，導致原本不能通過細胞膜的FITC進入其中，菌體內(nèi)可見綠色熒光的聚集。而刪除兩性多肽結(jié)構(gòu)的LysAB3-D處理后的AB菌體中卻未見有綠色熒光的聚集，提示裂解酶的兩性多肽結(jié)構(gòu)增加了細菌外膜通透性，削弱了菌體的密封性，不僅導致裂解酶進入其中降解肽聚糖，還可導致菌體內(nèi)重要物質(zhì)如DNA的丟失、滲透壓的改變，最終導致細菌的裂解。下一步的研究將重組和表達這種兩性多肽結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，如果將其與抗菌藥物聯(lián)用，可成為一種“helper agent”[11]，來增加細菌外膜的通透性，有利于抗菌藥物進入其中發(fā)揮作用，提高抗菌藥物的殺菌能力。甚至還可找到一個兩性多肽結(jié)構(gòu)蛋白使用的恰當濃度，既可增加細菌外膜通透性，又不會徹底破壞細菌外膜的完整性，從而減少菌體裂解所導致的內(nèi)毒素釋放，而這正是裂解酶應用于抗菌治療中所存在的最大問題[12]。

裂解酶LysAB3通過其C端的兩性多肽結(jié)構(gòu)來增加AB外膜的通透性，輔助具有酶解催化域的N端降解肽聚糖共價鍵，導致細菌裂解，達到抗菌目的[13]。在下一步的研究中，可通過重組和表達這種兩性多肽結(jié)構(gòu)蛋白來增加細菌外膜的通透性，從而提高抗菌藥物的效力，減少耐藥率的發(fā)生[14-15]。

[1]Dijkshoorn L,Nemec A,Seifert H.An increasing threat in hospitals:multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J].Nat Rev Microbiol,2007,5(12):939-951.

[2]Popova AV,Zhilenkov EL,Myakinina VP,et al.Isolation and characterization of wide host range lytic bacteriophage AP22 infecting Acinetobacter baumannii[J].FEMS Microbiol Lett,2012,332(1):40-46.[3]Lai MJ,Lin NT,Hu A,et al.Antibacterial activity of Acinetobacter baumannii phage AB2 endolysin(LysAB2) against both gram-positive and gram-negative bacteria[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,90(2):529-539.

[4]Lin NT,Chiou PY,Chang KC,et al.Isolation and characterization of phi AB2:a novel bacteriophage of Acinetobacter baumannii[J].Res Microbiol,2010,161(4):308-314.

[5]Mangoni ML,Papo N,Barra D,et al.Effects of the antimicrobial peptide temporin L on cell morphology,membrane permeability and viability of Escherichia coli[J].Biochem J,2004,380(Pt3):859-865.

[6]Huang G,Le S,Peng Y,et al.Characterization and genome sequencing of phage Abp1,a new phiKMV-like virus infecting multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J].Curr Microbiol,2013,66(6):535-543.

[7]Li P,Chen B,Song Z,et al.Bioinformatic analysis of the Acinetobacter baumannii phage AB1 genome[J].Gene,2012,507(2):125-134.

[8]Yele AB,Thawal ND,Sahu PK,et al.Novel lytic bacteriophage AB7-IBB1 of Acinetobacter baumannii:isolation,characterization and its effect on biofilm[J].Arch Virol,2012,157(8):1441-1450.

[9]Orito Y,Morita M,Hori K,et al.Bacillus amyloliquefaciens phage endolysin can enhance permeability of Pseudomonas aeruginosa outer membrane and induce cell lysis[J].Appl Microbiol Biotechnol,2004,65(1):105-109.

[10]Morita M,Tanji Y,Orito Y,et al.Functional analysis of antibacterial activity of Bacillus amyloliquefaciens phage endolysin against Gram-negative bacteria[J].FEBS Letters,2001,500(1/2):56-59.[11]Kang SJ,Park SJ,Mishig-Ochir T,et al.Antimicrobial peptides:therapeutic potentials[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2014,12(12):1477-1486.

[12]Chen L,Zhu Y,Yang D,et al.Synthesis and antibacterial activities of antibacterial peptides with a spiropyran fluorescence probe[J].Sci Rep,2014,4:6860.

[13]BorysowskiJ,Weber-DabrowskaB,GorskiA.Bacteriophageendolysinsasanovelclassofantibacterialagents[J].Exp Biol Med (Maywood),2006,231(4):366-377.

[14]Coulter LB,McLean RJ,Rohde RE,et al.Effect of bacteriophage infection in combination with tobramycin on the emergence of resistance in Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa biofilms[J].Viruses,2014,6(10):3778-3786.

[15]Chan BK,Abedon ST.Bacteriophages and their Enzymes in Biofilm Control[J].Curr Pharm Des,2014,21(1):85-99.

Effects of the amphiphilic peptides on membrane permeability of Acinetobacter baumannii*

ZhangJie1,ChenYong1,ZengYing1△,LiXiujuan2

(1.DepartmentofGeriatricsMedicine,theThirdPeople′sHospitalofChongqing,Chongqing400014,China;2.DepartmentofInternalMedicine,theFirstBranch,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400015,China)

Objective To investigate effects of the amphiphilic peptides on membrane permeability of acinetobacter baumannii.Methods The LysAB3 and LysAB3-D (lack of amphiphilic peptides structure gene) was synthesized and inserted into the vector pET28a(+) to construct the recombinant expression plasmid (pET28a-LysAB3,pET28a-LysAB3-D).After expression in E.coli BL21(DE3) and purification with Ni2+-NTA Sepharose.Acinetobacter baumannii was observed by scanning electron microscopy and fluorescence microscope,pretreated with LysAB3 and LysAB3-D respectively.Results Under scanning electron microscopy,LysAB3-treated acinetobacter baumannii exhibited not only significant abnormalities,including deep roughening of the cell surface,but also FITC readily accumulated in bacteria.It was different from LysAB3-D-treated.Conclusion These results indicate that the amphiphilic peptides structure increase membrane permeability of acinetobacter baumannii,which helps LysAB3 degrade bacteria.

bacteriophage;endolysin;amphiphilic peptides;Acinetobacter baumannii;membrane permeability

·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.09.003

重慶市衛(wèi)計委科研基金資助項目(2013-2-097)；重慶市渝中區(qū)科技計劃基金資助項目(20130149)。

張劼(1978-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事臨床呼吸研究。

△通訊作者,Tel：13996306381；E-mail:775899006@qq.com。

Q939

A

1671-8348(2015)09-1162-03

2014-10-09

2014-12-03)