大分子擁擠條件下光誘導辣根過氧化物酶還原的光譜研究

曹洪玉，王 珍，唐 乾，鄭學仿

（1．大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連116622；2．大連大學 遼寧省生物有機化學重點實驗室，遼寧 大連116622；3．大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連116622）

蛋白質、核酸、多糖等大分子物質在細胞內的濃度很高，使得細胞內的環(huán)境是高度擁擠的，大分子在細胞內的濃度可高達80～400g／L［1］，能占細胞總容積的20%～30%［2］，由于排斥容積效應，任何可增加可用容積的反應都能被大分子擁擠試劑刺激發(fā)生［3－6］。在生物體內，大多數(shù)的生化反應都是在這種高度擁擠的環(huán)境中完成的，當?shù)鞍状嬖谟诖蠓肿訐頂D環(huán)境中時，其微環(huán)境會發(fā)生改變，使得蛋白的結構及穩(wěn)定性發(fā)生變化［2，7］，從而使得蛋白的功能表達在擁擠試劑和稀溶液中不同。

生命體的重要組成部分——血紅素類蛋白，在生命體中承擔著極其重要的功能，例如作為生物催化劑、電子傳遞蛋白、氧載體和生物傳感器等［8］。由于血紅素類蛋白含有原卟啉Ⅸ輔基，故其能夠吸收特定波長的光，光照通過影響血紅素功能的表達而影響蛋白功能。關于光照射血紅素類蛋白的研究已有報道，如血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素P450、細胞色素C、細胞色素C氧化酶和辣根過氧化物酶等［9－14］，但是這些研究是在稀溶液中進行的，忽略了生物體細胞內的擁擠環(huán)境。目前關于血紅素類蛋白在高度擁擠環(huán)境下光照的研究還很少。

辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）是以鐵卟啉為輔基的血紅蛋白，辣根過氧化物酶能利用過氧化氫氧化一些有機和無機化合物，它與植物的呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都緊密相關，而且對氧自由基具有消除作用，減少過氧化物對植物體的毒害作用。辣根過氧化物酶在生物傳感器［15］、環(huán)境監(jiān)測、工業(yè)應用［16］等方面也發(fā)揮了很大的作用，廣泛地運用于基因學、生理學及病理學研究中［17，18］。

我們最近研究了紫外－可見光誘導細胞色素C、高鐵肌紅蛋白［19，20］和 HRP的還原及其機制，發(fā)現(xiàn)它們的光還原反應機制都是光誘導分子內電子轉移。為了進一步了解光誘導血紅素蛋白在細胞內環(huán)境中的還原過程，本文通過在光照體系中加入大分子擁擠試劑來模擬細胞內環(huán)境，研究了該條件下光誘導HRP的還原，利用紫外－可見吸收光譜、同步熒光光譜及圓二色譜等方法對擁擠環(huán)境中光照射HRP后其血紅素中鐵原子價態(tài)、蛋白構象及二級結構的變化進行了研究，確定了擁擠環(huán)境中HRP的最適光還原條件，分析了光照波長、溫度、擁擠試劑濃度等對HRP光還原的影響。

1 實驗部分

1．1 試劑與儀器

辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）樣品購自美國Sigma公司，使用時未經(jīng)進一步提純，溶解在0．05mol／L的 Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液（pH＝7．4）中，配置成濃度為5×10－4mol／L的蛋白溶液，蛋白溶液冷凍避光保存并盡快應用于實驗。

Dextran70和Ficoll70購自上海生工公司，分別將大分子擁擠試劑Dextran70和Ficoll70溶解到pH 7．4的PB緩沖溶液中，使其終濃度達到50g／L、100 g／L、200g／L和400g／L，實驗用水為去離子水。

實驗儀器主要有 UV－Vis分光光度計（V－560，日本Jasco公司），熒光光譜儀（FP－6500，日本Jasco公司）和圓二色光譜儀（J－810，日本Jasco公司），制冷和加熱循環(huán)器（F－12，德國Julabo公司），實驗室pH計（PHSJ－4A，上海雷磁分析儀器廠），實驗所用光源為熒光光譜儀的氙燈。

1．2 實驗過程

1．2．1 樣品處理

取20μL濃度為5×10－4mol／L的 HRP蛋白分別加入到1．98mL PB緩沖液和已配好的Dextran70、Ficoll70溶液中，得到濃度為5×10－6mol／L的HRP蛋白溶液，將蛋白樣品置于10mm石英比色池中，密封并持續(xù)通入N2，用熒光光譜儀中的氙燈進行光照，然后進行光譜測定。

1．2．2 光譜測定

UV－Vis光譜測定：狹縫寬度2nm，掃描波長范圍220～700nm，掃描速度200nm／min，響應時間為中等，累計掃描3次。

熒光光譜測定：將擁擠試劑Dextran70和Ficoll70放入10mm石英比色池中進行熒光光譜測定，測定條件為：激發(fā)波長280nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，掃描速度為500nm／min，響應時間為0．5s，檢測器靈敏度為中等，累計掃描3次。

同步熒光光譜測定：以Δλ＝20nm和Δλ＝60 nm測定處理后樣品的同步熒光光譜。激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5nm，掃描速度為500nm／min，響應時間為0．5s，檢測器靈敏度為中等，累計掃描3次。

圓二色光譜測定：狹縫寬度1nm，掃描波長范圍190～250nm，掃描速度50nm／min，響應時間1s，累計掃描3次。

2 結果與討論

2．1 稀溶液／擁擠環(huán)境中HRP的紫外－可見與同步熒光光譜

在稀溶液中，辣根過氧化物酶在403nm處的吸光度為0．43，在擁擠試劑Dextran70與Ficoll70中，HRP在403nm處的吸光度分別為0．48和0．49，與稀溶液中的HRP蛋白在403nm處的紫外吸收強度相比，擁擠試劑中的HRP蛋白在403 nm處的紫外吸收強度要強。這是由于擁擠試劑對血紅素周圍的環(huán)境有一定的影響，血紅素在擁擠試劑中暴露較多，使得吸光度較強。HRP的紫外－可見吸收光譜見圖1。

圖1 HRP的紫外－可見吸收光譜

色氨酸殘基和酪氨酸殘基是蛋白質熒光的主要貢獻因素［21］。利用同步熒光光譜可得到酪氨酸和色氨酸殘基的特征峰。當選擇Δλ＝20nm時顯示的是酪氨酸殘基的熒光峰，當選擇Δλ＝60nm時表現(xiàn)的則是色氨酸殘基的熒光峰，并且色氨酸殘基的熒光強度和位置對其周圍的環(huán)境是敏感的［22］。色氨酸殘基的最大發(fā)射波長紅移，表明其所處環(huán)境極性增加，疏水性降低，蛋白疏水結構瓦解，肽鏈伸展程度有所增加；藍移則表明疏水性增加，分子趨于折疊狀態(tài)［23］。我們可以根據(jù)這些現(xiàn)象來判斷蛋白質的構象變化［21］。

在稀溶液中，Δλ＝20nm時（圖2A），HRP的酪氨酸殘基的熒光峰在305nm處，Δλ＝60nm（圖2B）時，HRP的色氨酸殘基的熒光峰在344nm處。由于擁擠試劑自身能夠吸收一定波長的光而發(fā)射出熒光（圖3），所以在稀溶液中加入擁擠試劑時，使得HRP蛋白溶液的熒光強度急劇增強，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光峰被掩蓋。與相同濃度的Dextran70相比，F(xiàn)icoll70的熒光強度更強（圖3C）。

2．2 不同溶液中HRP的光還原

圖2 不同溶液中HRP的同步熒光光譜

圖3 大分子擁擠試劑Dextran70和Ficoll70的同步熒光光譜（A）Δλ＝20nm；（B）Δλ＝60nm；（C）熒光光譜

圖4 24℃，403nm光照射不同溶液中HRP其Soret帶吸收峰面積的變化

辣根過氧化物酶在稀溶液與大分子擁擠試劑中采用403nm單色光照射前后Soret帶吸收峰面積變化情況如圖4。從圖可以看出，403nm光照射 時，HRP在PB溶液及Dextran 7 0溶液中可以發(fā)生光還原反應，而在Ficoll70溶液中沒有發(fā)生光還原反應。在PB溶液中HRP蛋白隨著光照時間的增長被光還原的量增多，而在Dextran70溶液中，光照0．5h之內HRP蛋白被還原的量較多，隨著光照時間的增長HRP蛋白被還原的量有所減少。辣根過氧化物酶在稀溶液與大分子擁擠試劑中，分別采用280nm單色光照射前后其Soret帶吸收峰面積變化情況如圖5。從圖中可以看出，HRP蛋白在擁擠試劑Dextran70和Ficoll70溶液中有利于光還原反應的發(fā)生，并且相同光照時間內，在Ficoll70溶液中HRP蛋白被光還原的量更多。HRP的光還原機理為光誘導的蛋白分子內電子轉移，在擁擠條件下HRP蛋白光還原反應易于發(fā)生的主要原因是：擁擠試劑Dextran70和Ficoll70自身均能發(fā)射熒光，在Dextran70和Ficoll70溶液中HRP蛋白的光還原程度不同，也體現(xiàn)了這兩種擁擠試劑光吸收和熒光發(fā)射的差異。這種差異是由擁擠試劑結構的不同造成的，Dextran70的持續(xù)長度約為0．4nm，是一種無交聯(lián)線性的、相對靈活的大分子聚合物，而Ficoll70具有高度交聯(lián)的結構，是一種剛性共聚體。因此，當Dextran70與Ficoll70濃度相同時，Dextran70可以在溶液中形成準隨機螺旋，從而容納更多的間隙空間，排阻體積效應變小，吸收光能力變弱，使得其熒光發(fā)射強度較小，不利于HRP蛋白分子內電荷轉移現(xiàn)象的發(fā)生。

2．3 光照波長對HRP光還原的影響

圖5 24℃，280nm光照射不同溶液中HRP其Soret帶吸收峰面積的變化

不同波長的光能量是不同的，對HRP的光還原情況不同，因此我們考察了擁擠條件下不同定波長光照射HRP溶液的光還原情況，圖6A為在擁擠試劑Dextran70溶液中，分別用272、280、403和498nm波長的光照射HRP蛋白樣品后，其Soret帶吸收峰面積隨光照時間的變化。發(fā)現(xiàn)272和498nm兩種波長的光不能使HRP蛋白發(fā)生光還原反應。而280和403nm兩種波長的光照射HRP蛋白溶液可以使其發(fā)生光還原反應。圖6B為在擁擠試劑Ficoll70溶液中，分別用280、403和498nm波長的光照射HRP蛋白樣品后，其Soret帶吸收峰面積隨光照時間的變化。發(fā)現(xiàn)只有280 nm波長的光照射蛋白溶液時能使HRP發(fā)生光還原反應。造成這種現(xiàn)象的原因是擁擠試劑Ficoll70在280nm處有紫外吸收，采用280nm波長的光照射HRP蛋白溶液，可以激發(fā)擁擠試劑Ficoll70發(fā)射熒光，從而誘導HRP發(fā)生還原。

圖6 擁擠條件下不同定波長光照射HRP溶液后其Soret帶吸收峰面積的變化

2．4 溫度對HRP光還原的影響

溫度的改變可引起HRP蛋白構象發(fā)生變化，而HRP蛋白構象的變化會影響其酶活性。為此我們考察了不同溫度（4℃、24℃、44℃）對大分子擁擠環(huán)境中HRP光還原的影響。

圖7 不同溫度下光照HRP其Soret帶吸收峰面積隨時間的變化

在擁擠試劑Dextran70中（圖7A），HRP蛋白溶液在4℃、24℃、44℃三種溫度下采用403nm單色光照射0．5h后，其Soret帶吸收峰面積減小都比較明顯。在溫度為24℃時，隨著光照時間的增長，Soret帶峰吸收峰面積趨于平緩，在溫度為4℃和44℃時，隨著光照時間的增長，Soret帶吸收峰面積越來越小，且4℃時Soret帶峰面積減少更明顯，說明在Dextran70大分子擁擠環(huán)境中，403nm單色光照、4℃時最有利于HRP光還原反應的發(fā)生。在擁擠試劑Ficoll70中（圖7B），HRP蛋白溶液在4℃、24℃、44℃三種溫度下采用280nm單色光照射，隨著光照時間的增加，其Soret帶吸收峰面積逐漸減少，在24℃，Soret帶吸收峰面積減少程度最明顯，說明在擁擠試劑Ficoll70中，280nm單色光照、24℃時，最有利于HRP光還原反應的進行。

2．5 擁擠試劑濃度對HRP光還原的影響

圖8為不同濃度大分子擁擠試劑中HRP光還原的情況。大分子擁擠試劑Dextran70濃度為100g／L時，光照后HRP蛋白在Soret帶吸收峰面積減少的最多，濃度為400g／L時Soret帶吸收峰面積反而增加。說明Dextran70濃度為100g／L時光照還原HRP的能力最強?？赡苁荄extran70在較高濃度時使得HRP蛋白的血紅素暴露增多，Soret帶的吸收峰面積增大，且當Dextran70濃度達到200g／L時會發(fā)生濃度熒光猝滅，其熒光發(fā)射強度降低，引起HRP光還原程度降低。在大分子擁擠試劑Ficoll70中，光照后HRP蛋白在Soret帶吸收峰面積隨著Ficoll70濃度的增大而逐漸減小，F(xiàn)icoll70濃度為400g／L時吸收峰面積減少的最多，即濃度為400g／L時HRP的光還原能力最強。Ficoll70濃度增加其熒光發(fā)射強度則會逐漸增強，從而使HRP的光還原程度增大。

圖8 光照后不同濃度大分子擁擠試劑中HRP Soret帶吸收峰面積的變化

2．6 擁擠環(huán)境中光照射HRP二級結構的變化

某些反應引起的蛋白分子二級結構變化可以通過CD光譜進行檢測，因此，我們選用遠紫外區(qū)CD光譜對擁擠環(huán)境中光誘導HRP還原所引起的蛋白二級結構的變化進行檢測，進一步了解擁擠環(huán)境中光誘導HRP蛋白的還原過程。不同光照時間HRP的遠紫外CD光譜如圖9。由圖可知，稀溶液和擁擠試劑中的辣根過氧化物酶在208nm和222nm均表現(xiàn)出兩個負峰，反映的是α－螺旋結構蛋白的特征譜帶，隨著光照時間的增加（0．5h、1h、2h、3h）HRP在稀溶液與擁擠試劑中208nm和222nm的兩個負峰未發(fā)生變化，說明光照時間內蛋白未變性，光照后蛋白的二級結構未發(fā)生改變。

圖9 不同溶液中HRP光照后的CD光譜CD spectra of HRP under different solutions

3 結論

本文通過光譜法，對光誘導大分子擁擠環(huán)境中辣根過氧化物酶的還原過程進行了研究，結果表明大分子擁擠試劑對光還原HRP的電子傳遞過程及效率有影響。當采用403nm單色光照射HRP蛋白溶液時，HRP在擁擠試劑葡聚糖70（Dextran70）中還原程度較好，而在聚蔗糖70（Ficoll70）擁擠環(huán)境下HRP不發(fā)生光還原反應；采用280nm單色光照射時，在大分子擁擠試劑葡聚糖70（Dextran70）和聚蔗糖70（Ficoll70）環(huán)境中，HRP光還原反應得到促進，且大分子Ficoll70溶液對HRP光還原反應的促進作用更加明顯；光誘導HRP還原的最適溫度在Dextran70和Ficoll70溶液中分別為4℃和24℃，定波長280nm光照射利于HRP還原；HRP在Dextran70溶液中的最適光還原濃度是100g／L，在Ficoll70環(huán)境中HRP還原程度隨著Ficoll70濃度的增加增大；通過CD光譜可知光照射擁擠環(huán)境中HRP被還原后，其二級結構基本沒有變化。

［1］ Ellis R．Macromolecular crowding：obvious but underappreciated［J］．Trends in Biochemical Science，2001，26：597－604．

［2］ Perham M，Stagg L，Wittung－Stafshede P．Macromolecular crowding increases structural content of folded proteins［J］．Febs Letters，2007，581（26）：5065－5069．

［3］ Zimmerman S B，Minton A P．Macromolecular crowding：biochemical，biophysical，and physiological consequences［J］．Annual Review of Biophysics and Biomological Structures，1993，22：27－65．

［4］ Minton A P． Models for excluded volume interaction between an unfolded protein and rigid macromolecular cosolutes：macromolecular crowding and protein stability revisited［J］．Biophysical Journal，2005，88（2）：971－985．

［5］ Minton A P．Influence of macromolecular crowding upon the stability and state of association of proteins：predictions and observations ［J］．Journal of Pharmaceutical Science，2005，94（8）：1668－1675．

［6］ Zhou H X．Protein folding and binding in confined spaces and in crowded solutions［J］．Journal of Molecular Recognition，2004，17（5）：368－375．

［7］ Zhu J，He H W，Li S．Macromolecular crowding enhances thermal stability of rabbit muscle creatine kinase［J］．Tsinghua Science and Technology，2008，13（4）：454－459．

［8］ 林英武，黃仲賢．血紅蛋白結構及功能相互轉換［J］．世界科技研究與發(fā)展，2006，28：8．Lin Y W，Huang Z X．Structural and functional conversion between hemoproteins［J］．World Science－Technology R ＆D，2006，28：8．

［9］ Pierre J，Bazin M，Debey P，Santus R．One－electron photoreduction of bacterial cytochrome P－450by ultraviolet light．I．steady－state irradiations ［J］．European Journal of Biochemistry，1982，124（3）：533－537．

［10］ Sakai H，Onuma H，Umeyama M，TAkeoka S，Tsuchida E．Photoreduction of methemoglobin by irradiation in the near－ultraviolet region［J］．Biochemistry，2000，39（47）：14595－14602．

［11］ Liang X Q，Chen G F，Zhang X，Liu S，Li G X．Study of UVA irradiation on hemoglobin in the presence of NADH［J］．Journal of Photochemistry and Photobiology B，2008，90（1）：53－56．

［12］Vorkink W P，Cusanovich M A．Photoreduction of horse heart cytochrome c ［J］．Photochemistry and Photobiology，1974，19（3）：205－215．

［13］ Masuda T，Minemura A，Yamauchi K，Kondo M．A mechanism of direct photoreduction of ferricytochrome c［J］．Journal of Radiation Research，1980，21（2）：149－156．

［14］ Winterle J S，Einarsdóttiró．Photoreactions of cytochrome c oxidase［J］．Photochemistry and Photobiology，2006，82（3）：711－719．

［15］ 李 軍，王柯敏，肖 丹，羊小海．改進溶膠－凝膠法固定酶結構剖析及在苯酚光化學傳感器中的應用 ［J］．高等學?；瘜W學報，2000，21（7）：1018－1022．Li J，Wang K，Xiao D，Yang X H．The microstructure analysis of enzymes immobilized by sol－gel method and its application in phenol optical chemical sensor［J］．Chemical Journal of Chinese University，2000，21（7）：1018－1022．

［16］ 周海峰，楊東杰，邱學青，伍曉蕾．辣根過氧化物酶改性木質素磺酸鈉的結構特征及吸附分散性能 ［J］．高等學?；瘜W學報，2014，35（4）：895－902．Zhou H F，Yang D J，Qiu X Q，Wu X L．Structural characterization，adsorption and dispersion properties of sodium lignosulfonate by horseradish peroxidase incubation［J］．Chemical Journal of Chinese University，2014，35（4）：895－902．

［17］ Taraban M B，Anderson M A．Magnetic field dependence of electron transfer and the role of electron spin in heme enzymes：horseradish peroxidase［J］．Journal of the American Chemical Society，1997，1199（24）：5768－5769．

［18］ Baek H K，Van Wart H E．Elementary steps in the formation of horseradish peroxidase compound I：direct observation of compound 0，a new intermediate with a hyperporphyrin spectrum［J］．Biochemistry，1989，28（14）：5714－5719．

［19］ 顧曉天，吳曉紅，周家宏，魏少華，劉 穎，馮玉英．竹紅菌甲素與細胞色素C相互作用的同步熒光光譜研究［J］．南京師范大學學報，2005，28：70．Gu X T，Wu X H，Zhou J H，Wei S S H，Liu Y，F(xiàn)eng Y Y．Study on the interaction between hypocrellin a and cytochrome c using synchronous fluoresecence of spectra［J］．Journal of Nanjing Normal University，2005，28：70．

［20］ 楊昌英，李 敏，付 靜，李 昕．脂質體對細胞色素C結構的穩(wěn)定作用 ［J］．分析科學學報，2010，26：153．Yang C Y，Li M，F(xiàn)u J，Li X．Structral stability of cyto chrome c in egg phosphatidylcholine liposomes［J］．Journal of Analytical Science，2010，26：153．

［21］ Joseph R L．Principles of Fluorescence Spectroscopy［M］．New York：Plenum Press，1983．533．

［22］ Munk M B，Huvaere K，Bocxlaer J V，Skibsted L H．Mechanism of light－induced oxidation of nitrosylmyoglobin［J］．Food Chemistry，2010，121（2）：472．

［23］ 馬 靜，鄭學仿，唐乾，楊彥杰，孫 霞，高大彬．光譜法研究Cu2＋與肌紅蛋白的相互作用［J］．高等學校化學學報，2008，29（2）：258－263．Ma J，Zheng X F，Tang Q，Yag Y J，Sun X，Gao D B．Spectroscopic studies on the interaction of Cu2＋with myoglobin［J］．Chemical Journal of Chinese University，2008，29（2）：258－263．