4種糖漿劑微生物限度檢查方法的建立*

檀巧婷，嚴(yán)佳，周欣，宋洪濤

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福州 350025)

4種糖漿劑微生物限度檢查方法的建立*

檀巧婷，嚴(yán)佳，周欣，宋洪濤

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福州 350025)

目的建立氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿、鹽酸苯海拉明糖漿和馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿的微生物限度檢查方法。方法采用2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》微生物限度檢查的常規(guī)法、培養(yǎng)液稀釋法對(duì)4種糖漿進(jìn)行5種菌的微生物限度檢查及方法學(xué)驗(yàn)證。進(jìn)行試驗(yàn)的每種糖漿劑均分為試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組及稀釋劑對(duì)照組。結(jié)果4種糖漿劑采用常規(guī)法時(shí)，氯化銨糖漿5種菌的回收率為72.0%～85.5%；硫酸亞鐵糖漿77.3%～88.5%；鹽酸苯海拉明糖漿78.2%～90.1%，僅有馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿對(duì)5種試驗(yàn)菌株的回收率為37.4%～52.7%，低于70%，證明其有抑菌作用，而采用培養(yǎng)液稀釋法后，回收率為80.3%～92.7%，微生物限度檢查結(jié)果符合要求。結(jié)論氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿和鹽酸苯海拉明糖漿微生物限度檢查可采用常規(guī)法，而馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿采用培養(yǎng)液稀釋法；控制菌檢查均可按照常規(guī)法進(jìn)行。

糖漿劑；微生物限度；稀釋法，培養(yǎng)液

糖漿是指含藥物的濃蔗糖溶液，含蔗糖量不低于45%(g·mL-1)[1]。糖漿含有高濃度的糖，多食傷脾，糖尿病患者也不宜服用，但由于其能掩蓋某些藥物的苦味、咸味及其他不適臭味，容易服用，臨床療效明顯，尤其受兒童歡迎，因而受到廣泛應(yīng)用。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版規(guī)定，糖漿劑需進(jìn)行微生物限度檢查。結(jié)合總后勤部衛(wèi)生部開(kāi)展的軍隊(duì)醫(yī)療制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃，筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)，確定了氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿、鹽酸苯海拉明糖漿和馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿的微生物限度檢查方法，并結(jié)合其處方組成，探討4種糖漿劑成分與微生物限度檢查方法的相關(guān)性。

1 儀器與材料

1.1 儀器和設(shè)備 GHP-9160型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一橫科技有限公司)、SW-CJ-1B型凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng))、MJPS-150型真菌培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、LDZX-40KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng))。

1.2 試驗(yàn)菌種 試驗(yàn)用菌分別是：白念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉 [CMCC(F)98003]、金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26003]、大腸埃希菌 [CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌 [CMCC(F)10104]，均由福建省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.3 培養(yǎng)液及稀釋液 本次試驗(yàn)所用到的改良馬丁培養(yǎng)液(批號(hào)：1211282)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)液(批號(hào)： 130910)、膽鹽乳糖培養(yǎng)液(批號(hào)：1204192)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)液(批號(hào)：111201)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液(批號(hào)：120417)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液(批號(hào)：120601)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)液(批號(hào)：130221)、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)液(批號(hào)：131124)和pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)：120329)均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供。

1.4 樣品 氯化銨糖漿(規(guī)格：每瓶100 mL，批號(hào)：131203)，硫酸亞鐵糖漿(規(guī)格：每瓶100 mL，批號(hào)：131203)，鹽酸苯海拉明糖漿(規(guī)格：每瓶100 mL，批號(hào)：131216)，馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿(規(guī)格：每瓶100 mL，批號(hào)：131216)，均由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備、計(jì)數(shù)及菌液稀釋度的確定

2.1.1 細(xì)菌菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至9 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，35 ℃培養(yǎng)24 h，制得菌懸液。取菌懸液1 mL用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液依次10倍稀釋至10-7，制成含菌數(shù)為50～100 cfu·mL-1的菌懸液[2-6]。

2.1.2 真菌菌液制備 接種白念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，制得白念珠菌菌懸液，取菌懸液1 mL，加至0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，依次作10倍稀釋至10-7，制成含菌數(shù)為50～100 cfu·mL-1的菌懸液。取黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入5 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(含0.05%聚山梨酯80)，洗脫孢子，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管，取菌懸液1 mL，加至9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(含0.05%聚山梨酯80)，依次稀釋至10-7，制成含孢子數(shù)為50～100 cfu·mL-1的孢子懸液[2-6]。

2.2 供試液制備 分別精密量取4種糖漿劑各10 mL，加pH值7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，制成1：10的供試液備用[2-6]。

2.3 回收率測(cè)定

2.3.1 常規(guī)法測(cè)定 試驗(yàn)組：分別取1：10的供試液1 mL和上述制備好的50～100 cfu·mL-1的試驗(yàn)菌液置無(wú)菌平皿中，加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液及玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)液，混合均勻，放置凝固后倒置培養(yǎng)，每株試驗(yàn)菌分別制備2個(gè)平皿，按規(guī)定培養(yǎng)條件培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果，記錄菌落數(shù)。菌液組：取等體積的上述50～100 cfu·mL-1試驗(yàn)菌液，同試驗(yàn)組操作。供試品對(duì)照組：不加菌液，同試驗(yàn)組操作，測(cè)定供試品菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組：取稀釋液1 mL和50～100 cfu·mL-1的試驗(yàn)菌液，同試驗(yàn)組操作。回收率見(jiàn)表1。氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿和鹽酸苯海拉明糖漿回收率均>70%，可采用常規(guī)法，而馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿回收率小于70%，對(duì)5種菌株均有抑菌作用，應(yīng)重新建立新的方法并驗(yàn)證。

表1 常規(guī)法驗(yàn)證試驗(yàn)回收率 %，n=3

樣品大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白念珠菌黑曲霉氯化銨糖漿77．872．080．577．185．5硫酸亞鐵糖漿81．277．386．488．582．1鹽酸苯海拉明糖漿86．778．290．180．484．0馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿50．344．847．137．452．7

2.3.2 培養(yǎng)液稀釋法 試驗(yàn)組：取50～100 cfu·mL-1的試驗(yàn)菌液和“2.2”項(xiàng)下的馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿供試液0.2 mL，分別加入10個(gè)無(wú)菌平皿中，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液及玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)液，混合均勻，放置凝固后倒置培養(yǎng)，每株試驗(yàn)菌分別制備10個(gè)平皿，培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果，記錄菌落數(shù)。菌液組、供試品對(duì)照組、稀釋劑對(duì)照組同“2.3.1”操作。測(cè)定菌落數(shù)，計(jì)算回收率。結(jié)果大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉回收率依次為80.3%，84.8%，90.1%，89.4%，92.7%(n=3)。故采用培養(yǎng)液稀釋法后，馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿回收率>70%，符合要求。

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.4.1 大腸埃希菌方法驗(yàn)證 試驗(yàn)組：取制備好的供試液10 mL及10～100 cfu·mL-1的大腸埃希菌菌液接種至100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液0.2 mL，接種至4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)液5 mL管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5，24 h置366 nm紫外燈下，觀察后，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，觀察有無(wú)玫瑰紅色產(chǎn)生。供試品對(duì)照組：取同等體積供試液，同試驗(yàn)組操作。陽(yáng)性對(duì)照組：按試驗(yàn)組的方法操作，不加供試液。陰性對(duì)照組：取稀釋液10 mL按試驗(yàn)組方法操作，不加菌液。

2.4.2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組、供試品對(duì)照組未檢出大腸埃希菌。4種供試品的控制菌檢測(cè)方法可以按常規(guī)法檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 控制菌檢查方法驗(yàn)證

+：檢出細(xì)菌；-：未檢出細(xì)菌

3 討論

氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿和鹽酸苯海拉明糖漿蔗糖濃度分別為62.6%，82.5%，72.2%，3種糖漿雖含糖濃度不同，但菌落生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，均采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查。糖漿含量在62%～82%范圍內(nèi)微生物的生長(zhǎng)與糖漿含量可能關(guān)系不大。也有文獻(xiàn)報(bào)道糖漿劑蔗糖含量在60%以?xún)?nèi)，微生物的生長(zhǎng)與糖漿劑蔗糖含量關(guān)系不大。糖漿的霉變、發(fā)酵與糖漿在生產(chǎn)過(guò)程中的衛(wèi)生條件、防腐措施、成品消毒和儲(chǔ)藏條件等因素有關(guān)[7]。

馬來(lái)酸氯苯那敏糖漿蔗糖濃度為68.0%，采用培養(yǎng)液稀釋法進(jìn)行微生物限度檢查，可能為處方中含有7%乙醇，增加其抑菌作用，采用常規(guī)法不能消除其抑菌性[8-13]。糖漿中的乙醇含量與微生物驗(yàn)證方法的關(guān)系，還有待進(jìn)一步考察。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)4種糖漿劑微生物限度檢查方法的研究，可見(jiàn)糖漿的微生物限度檢查方法與其處方組成有關(guān)。因此，微生物限度檢查方法并不是單純與藥品劑型相關(guān)，當(dāng)樣品成分、制劑生產(chǎn)工藝等條件發(fā)生改變時(shí)檢驗(yàn)方法都需要重新驗(yàn)證。

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2014-10-23

2015-01-02

*軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)課題(13ZJ01)

檀巧婷(1984-)，女，福建福州人，藥師，學(xué)士，研究方向：藥物分析。電話(huà)：0591-22859963，E-mail：tqt-010@163.com。

宋洪濤(1968-)，男，山東肥城人，主任藥師，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物新劑型和制劑新技術(shù)，藥物基因組學(xué)與個(gè)體化給藥研究。電話(huà)：0591-22859459，E-mail：sohoto@vip.163.com。

R944.1；R969.3

B

1004-0781(2015)12-1652-03

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.026