熒光分析活性氧在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖中的作用

王立英蘇海燕王璇周艷楊世杰（北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室,吉林0）（吉林省腫瘤醫(yī)院預(yù)防保健科,長春00）（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室,長春00）

熒光分析活性氧在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖中的作用

王立英1蘇海燕2王璇1周艷*1楊世杰31（北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室,吉林132013）2（吉林省腫瘤醫(yī)院預(yù)防保健科,長春130021）
3（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室,長春130021）

應(yīng)用熒光分析方法探討活性氧（Reactive oxygen species,ROS）在血管緊張素Ⅱ （AngiotensinⅡ,Ang Ⅱ）誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞（Myofibroblasts,myoFbs）增殖中的作用。實驗中采用胰酶消化法分離、培養(yǎng)原代新生大乳鼠myoFbs,10％胎牛血清培養(yǎng),采用2～3代myoFbs,并隨機(jī)分為正常對照組、AngⅡ處理組、N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）干預(yù)組,培養(yǎng)12、24和36 h后,分別采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4,5）-Dimethylthiahiazo（-z-yl）-3,5-diphenyt-etrazoliumromide,MTT）法測定myoFbs的增殖率；硝酸酶還原法檢測myoFbs產(chǎn)生羥自由基（·OH）的量；利用熒光探針DCFH-DA分析檢測myoFbs中ROS的水平；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法及熒光共聚焦測定p-PKCα的表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位。結(jié)果顯示一定濃度的AngⅡ作用myoFbs 24 h時myoFbs增殖率明顯增加（η值（％）為117.05）；并誘導(dǎo)myoFbs產(chǎn)生大量ROS,其中myoFbs增殖率越高,·OH的含量（94.53±1.68）越高；免疫細(xì)胞化學(xué)染色及熒光共聚焦可見,AngⅡ能明顯促進(jìn)p-PKCα的表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位（與對照組比較p＜0.01或p＜0.001）；NAC（10-4mol/L）可抑制AngⅡ引起myoFbs的增殖（OD值為0.357±0.13）,減少myoFbs內(nèi)ROS及·OH的量（75.57±1.48）,抑制p-PKCα的表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位。

N-乙酰半胱氨酸；血管緊張素Ⅱ；氧自由基；心肌成纖維細(xì)胞；蛋白激酶Cα；活性氧

1 引 言

在我國,心血管疾病已經(jīng)成為僅次于癌癥的第二號殺手,防止心血管疾病發(fā)生發(fā)展并降低其致死致殘率已成為我國21世紀(jì)提高人民健康水平的重中之重[1]。引起心臟病患者心肌組織變化主要是纖維細(xì)胞（Myofibroblasts,myoFbs）數(shù)量增多引起纖維化（Myofibrosis,MF）,主要是myoFbs的增殖及間質(zhì)的纖維化,并引起心臟收縮功能障礙、心律失常及室顫,最終引起難治性心力衰竭,這是多種心臟疾病發(fā)展的共同結(jié)局。臨床上抗MF和逆轉(zhuǎn)心肌重塑治療過程中,先治療心臟的原發(fā)病,同時加強(qiáng)抗MF的治療,因此,明確MF發(fā)生的機(jī)制,尋找有效抑制MF甚至逆轉(zhuǎn)MF的藥物,減少猝死的發(fā)生機(jī)率,具有重要的現(xiàn)實意義,并已成為醫(yī)學(xué)研究的重點[2,3]。

目前,MF發(fā)生機(jī)制的研究多側(cè)重于在體條件下各項指標(biāo)的檢測,細(xì)胞內(nèi)的信號分子研究較少,且均采用傳統(tǒng)的免疫生化指標(biāo)的檢測。為明確MF發(fā)生時的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,著手于體外培養(yǎng)myoFbs,采用熒光分析方法探討MF時細(xì)胞內(nèi)各種信號分子的變化,為MF的治療提供可靠依據(jù)。

大量研究表明,氧化應(yīng)激產(chǎn)生的各種氧自由基（Oxygen free radicals）對心血管具有細(xì)胞毒性作用,是許多心血管疾病發(fā)生的重要機(jī)理[4]。文獻(xiàn)[5]報道氧化應(yīng)激產(chǎn)生的適量氧自由基可作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。本研究以AngⅡ為myoFbs氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑,通過熒光探針DCFHDA,熒光共聚焦分析及NAC干擾,探討myoFbs增殖過程中ROS量的變化及在其中的作用,明確心肌重塑細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及治療靶點,為心血管疾病的防治提供參考。

本實驗的前期工作中發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C（Protein kinase C）參與到了MF過程中,在心肌PKC亞型中, PKCα在心肌的表達(dá)量最高,磷酸化后可由胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜,引起系列細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo),從而引起細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)改變。以往的研究多通過Westen blot等方法來探討PKCα在myoFbs增殖中的作用。本實驗通過熒光分析PKCα在myoFbs增殖及MF過程中的作用,為抗MF和逆轉(zhuǎn)心肌重塑提供了新的治療靶點。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑及動物

熒光共聚焦顯微鏡和CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；UV-5300紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；9602A酶標(biāo)儀（北京艾普生物設(shè)備有限公司）；HERAEUSCO2培養(yǎng)箱（中國蘇凈集團(tuán)安泰公司）?；钚匝鯔z測試劑盒（Reactive oxygen species assay kit,ROS碧云天生物技術(shù)研究所）；OH測定試劑盒（南京建成生物工程公司）。

Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（IMDM）培養(yǎng)基（Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶（Dfico公司）；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、NAC、血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）均購于Sigma公司；PKCα一抗（羊抗大鼠p-PKCα抗體,Santa Cruz公司）。Wistar乳鼠（清潔級,由吉林大學(xué)動物部提供）。

2.2 實驗分組和給藥

MyoFbs隨機(jī)分為對照組、AngⅡ處理組及NAC干預(yù)組。各組細(xì)胞無血清培育12 h后,均給予1％血清的IMDM培養(yǎng)基,除對照組外,均給予終濃度為10-7mol/L AngⅡ,NAC干預(yù)組同時給予NAC,終濃度為1×10-4mol/L。

2.3 MyoFbs的分離與培養(yǎng)

取Wistar大鼠,1～3日齡,無菌開胸取心臟,預(yù)冷D-Hank′s液清洗兩次,剪成1 mm3碎片,0.125％胰蛋白酶反復(fù)消化（37℃水浴,5min/次）,收集各次消化上清液,離心（1200 r/min,10min）,棄上清液,用含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸沉淀,制成細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶中,置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。實驗采用第2～3代細(xì)胞。

2.4 細(xì)胞增殖（M TT法）

將處于對數(shù)生長期的myoFbs制成細(xì)胞懸液,以1×105個/mL濃度接種于96孔板,每孔200μL。分別給予不同的處理因素作用48 h。每孔加入5 mg/LMTT溶液20μL,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),每孔加入150μL DMSO,振蕩10min后,酶標(biāo)儀上于490 nm波長測吸光度（A）。

2.5 MyoFbs內(nèi)·OH含量和ROS的測定

將處于對數(shù)生長期的myoFbs制成細(xì)胞懸液,以1×105個/mL濃度接種于96孔板,每孔200μL。分別給予不同的處理因素作用24 h,按試劑盒說明書進(jìn)行檢測。24孔板培養(yǎng)的myoFbs培養(yǎng)48 h后,各組無血清培育12 h,各種處理因素作用24 h后,以PBS溶液沖洗3次,去除細(xì)胞培養(yǎng)液；加入終濃度為10mmol/L DCFH-DA,在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用熒光共聚焦顯微鏡觀察myoFbs內(nèi)的ROS,顏色越深,表明ROS生成量越多。

2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測p-PKCα膜轉(zhuǎn)位和表達(dá)

將第3代myoFbs放入預(yù)先放置了10 mm×10 mm蓋玻片的24孔板,置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,各組無血清培育12 h,各種處理因素作用24 h后,將生長有myoFbs的蓋玻片取出,用預(yù)熱的PBS洗滌3次,每次5min,4％多聚甲醛固定30min,晾干后用SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,陽性反應(yīng)呈棕黃色細(xì)密顆粒。應(yīng)用MediaCybernetics公司的Image-Pro Plus5.0V圖像分析軟件分析各組p-PKCα 在myoFbs中表達(dá)的平均光密度值,每個視野取5個myoFbs。

2.7 熒光共聚焦檢測p-PKCα膜轉(zhuǎn)位和表達(dá)

MyoFbs的培養(yǎng)及處理的前期步驟同2.6節(jié),4％多聚甲醛固定30min,PBS洗滌3次,0.3％Triton X+100破膜15min,PBS或蒸餾水洗滌3次,1％胎牛血清封閉30min,蒸餾水沖洗3次后,加入1∶100稀釋的p-PKCα一抗（每孔300μL）,4℃過夜,次日PBS洗滌3次,加入1∶100稀釋的熒光標(biāo)記的兔抗山羊二抗（每孔200μL）,避光37℃孵育30min,每孔加入300μL PI繼續(xù)孵育15min,PBS洗滌3次后,每孔加500μL PBS,檢測,陽性反應(yīng)呈綠色細(xì)密顆粒。應(yīng)用Image-Pro Plus5.0V圖像分析軟件分析各組p-PKCα在myoFbs中表達(dá)的平均綠色光密度值,每個視野取5個myoFbs。此方法便于直接觀察p-PKCα的膜轉(zhuǎn)位及表達(dá)量的變化。紅色代表myoFbs的胞核。

3 結(jié)果與討論

3.1 AngⅡ?qū)w外培養(yǎng)的myoFbs增殖作用的影響

細(xì)胞增殖率按給藥與對照組吸光度（A490）的百分比計算得出。從表1數(shù)據(jù)可知,不同濃度的AngⅡ作用myoFbs12 h時,與對照組相比,與對照組相比細(xì)胞增殖不明顯；作用24 h時,與對照組相比,不同濃度AngⅡ（10-8～10-6moL/L）均可促進(jìn)myoFbs增殖。濃度為10-7moL/L的AngⅡ作用時間為24 h,在三組中細(xì)胞增殖率達(dá)到最大（η,％為170.15）,隨著AngⅡ濃度的升高,作用時間的延長,細(xì)胞增殖率反而逐漸降低。目前認(rèn)為,腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活是誘發(fā)及引起MF的主要發(fā)病機(jī)制, AngⅡ是最為常見的胞外刺激信號,也是重要的致炎致纖維化的因子,是引起MF致心肌重塑的關(guān)鍵物質(zhì)。AngⅡ可與血管緊張素受體1（AT1）結(jié)合激活蛋白激酶C-絲裂素活化蛋白激酶系統(tǒng)[6]一系列細(xì)胞信號途徑促進(jìn)myoFbs增殖。MyoFbs增殖需要適宜的AngⅡ濃度及作用時間。若濃度過低、時間過短, myoFbs增殖不明顯；而濃度過高、時間過長、由于滲透壓及營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡等,myoFbs增殖反而降低。由表1可知,AngⅡ作用細(xì)胞24h,濃度為10-7moL/L時,與各對照組相比,細(xì)胞增殖率明顯升高（p＜0.001）。

3.2 NAC對AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs增殖的抑制作用

AngⅡ作用myoFbs 24 h后與對照組相比,細(xì)胞增殖率明顯升高（p＜0.01）；與AngⅡ組相比,NAC組細(xì)胞增殖率明顯降低（p＜0.01）。NAC可抑制AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs增殖的作用。NAC分子中的活性巰基（-SH）,可對抗不同原因所致的組織氧化損傷。對體內(nèi)氧自由基（超氧陰離子·、H2O2、羥自由基·OH等）具有明顯的拮抗作用；由于NAC易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),對能透過細(xì)胞膜與多種細(xì)胞成分反應(yīng)、導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷壞死并發(fā)生纖維化的H2O2、·OH具有抑制、清除作用[7],而抑制 myoFbs增殖,減輕MF,見表2。

表1 不同濃度的AngⅡ在不同時間對myoFbs增殖的影響Table 1 Effect of angiotensinⅡ（AngⅡ）on the proliferation ofmyofibroblasts（myoFbs）in different concentrations and time

表2 NAC對AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs增殖的抑制作用（±s）Table 2 Inhibition of N-actyl-L-cysteine（NAC）on the proliferation of myoFbs induced by AngⅡ（mean±SD）group.

表2 NAC對AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs增殖的抑制作用（±s）Table 2 Inhibition of N-actyl-L-cysteine（NAC）on the proliferation of myoFbs induced by AngⅡ（mean±SD）group.

ap＜0.001與對照組比較；bp＜0.05 vs.AngⅡgroup。ap＜0.001 vs.control group；bp＜0.05 vs.AngⅡ

分組Group細(xì)胞增殖率Proliferation rate ofmyoFbs（η,％）12 h 24 h 36 h對照組Control group 100 100 100 AngⅡ（10-7moL/L） 0.389±0.17 0.483±0.12a 0.412±0.14 NAC（10-4moL/L） 0.341±0.14 0.357±0.13b 0.339±0.11

表3 NAC對AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs內(nèi)·OH含量的抑制作用（±s）Table 3 Inhibition of NAC on the content of OH· in myoFbs induced by AngⅡ（mean±SD）

表3 NAC對AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs內(nèi)·OH含量的抑制作用（±s）Table 3 Inhibition of NAC on the content of OH· in myoFbs induced by AngⅡ（mean±SD）

ap＜0.05與對照組比較；bp＜0.01與AngⅡ組比較。ap＜0.05 vs.control group；bp＜0.01 vs.AngⅡgroup.

分組Group心肌成纖維細(xì)胞中·OH的含量The content of·OH in myoFbs（U/mL）12 h 24 h 36 h對照組Control group 79.45±1.43 81.25±1.25 78.90±1.73 AngⅡ（10-7moL/L） 89.50±1.38a 94.53±1.68a 91.07±1.06 NAC（10-4moL/L） 79.41±2.51b 75.57±1.48b 74.92±1.18

3.3 NAC對AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs內(nèi)·OH含量的影響

由表 3可見,AngⅡ作用于myoFbs不同時間,引起myoFbs產(chǎn)生·OH的量呈時間依賴性,隨著時間延長,myoFbs內(nèi)·OH的量逐漸增加,與對照組相比差異顯著（p＜0.01）。NAC干預(yù)組與AngⅡ處理組相比,·OH的產(chǎn)生量明顯降低（p＜0.05）,而與對照組相比差異不顯著（p＞0.05）?？梢奛AC對myoFbs內(nèi)·OH的產(chǎn)生具有抑制作用。NAC能夠通過減少·OH的生成而抑制myoFbs的增殖。

3.4 NAC對AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs內(nèi)ROS含量的影響

采用熒光共聚焦顯微鏡直接觀察myoFbs內(nèi)ROS量的變化,在myoFbs胞漿中可見到綠色的熒光顆粒,便是ROS的表達(dá),綠色越深,表明ROS量越高。與對照組相比,AngⅡ組ROS量最多（p＜0.01）；與AngⅡ組相比,NAC組ROS含量較少（p＜0.05）,見圖1A。圖1B是應(yīng)用Image-Pro Plus5.0V圖像分析軟件分析圖1A各組ROS的量繪制而成。

圖1 熒光共聚焦（A）和定量分析（B）N-乙酰半胱氨酸對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的影響（400×）Fig.1 NAC effects on content of reactive oxygen species（ROS）by AngⅡ in membrane ofmyoFbs with a laser confocal scanningmicroscope（A）and quantitative analysis（B）（400×）a：p＜0.01 vs control group；b：p＜0.05 vs AngⅡgroup.

利用活性氧檢測試劑盒測定ROS,活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行ROS檢測的試劑盒。DCFH-DA本身無熒光,可以自由穿過細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解,生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜,使探針很容易地被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH,生成DCF。檢測DCF的熒光即可知細(xì)胞內(nèi)ROS的水平[8,9]。由于myoFbs是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,因而采用原位裝載探針方法,即按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10μmol/L,去除細(xì)胞培養(yǎng)液,于24孔板的一個孔加入至少300μL已稀釋的DCFH-DA。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA[1]。AngⅡ能提高NADH/NADPH氧化酶的生物學(xué)活性及促進(jìn)ROS的產(chǎn)生,而引起心肌肥厚[10]。少量ROS可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的正常生理功能,而不損傷心肌細(xì)胞的作用。但在過量AngⅡ刺激因子的影響下,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶被異常激活,產(chǎn)生了過量ROS,引起MF[11]。ROS參與了MF的發(fā)生發(fā)展過程及導(dǎo)致心肌重塑[12]。此種測定ROS量的方法適用于各種貼壁細(xì)胞。

3.5 NAC對AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs內(nèi)p-PKCα膜轉(zhuǎn)位及表達(dá)的影響

圖2 免疫化學(xué)分析（A）和定量分析（B）N-乙酰半胱氨酸對p-PKCα在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位及表達(dá)的影響（200×）Fig.2 NAC effect ontranslocation and expression of p-protein kinase Cα（p-PKCα）induced by AngⅡ in membrane ofmyoFbs with immunohistochemistry（A）and quantitive analysis（B）（200×）**：p＜0.01 vs.control group；*：p＜0.05 vs.AngⅡgroup.

免疫組化（圖2A）可見,褐色的深淺表明p-PKCα的表達(dá)和轉(zhuǎn)位情況,褐色越深,表明p-PKCα的表達(dá)和膜轉(zhuǎn)位越多；熒光共聚焦（圖3A）可見,綠色代表p-PKCα的表達(dá)和膜轉(zhuǎn)位,紅色代表myoFbs的胞核。綠色越深,表明p-PKCα的表達(dá)和膜轉(zhuǎn)位越明顯；利用Image-ProPlus5.0V圖像分析軟件分析圖2A和圖3A,分別得圖2B和圖3B。由以上可知：AngⅡ作用myoFbs48h后與對照組相比,p-PKCα的表達(dá)明顯增加（p＜0.01）；而NAC組卻降低了p-PKCα的表達(dá)。PKC（α,β1,β2,δ,ε和ζ）存在于成年大鼠和新生大鼠的成纖維細(xì)胞中[13]。AngⅡ可以與血管緊張素受體1（AT1）結(jié)合并激活PKC,從而引起成纖維細(xì)胞增殖[14]。有研究表明,PKCα參與MF過程[15],但目前對其在 MF過程中的作用研究甚少。PKCα涉及多種器官纖維化的過程,如腎臟和心臟[16],可能是引起其纖維化過程的必經(jīng)傳導(dǎo)的共同通路。因此,PKCα在MF過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有極其復(fù)雜的作用。正常生理情況下,未活化的PKCα只存在于胞漿中,當(dāng)AngⅡ作用于體外培養(yǎng)的myoFbs時,可促進(jìn)PKCα的活化形成p-PKCα,并大量表達(dá)在胞膜。AngⅡ是通過促進(jìn)p-PKCα的表達(dá)而引起MF（圖2）。

圖3 熒光共聚焦（A）和定量分析（B）分析N-乙酰半胱氨酸對p-PKCα在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位及表達(dá)的影響（400×）Fig.3 NACeffectsontranslocationandexpressionofp-PKCαinducedbyAngⅡinmembraneofmyoFbswith alaserconfocalscanningmicroscope（A）andquantitativeanalysis（B）（400×）**：p＜0.001vs.controlgroup；*p＜0.01vs.AngⅡgroup.

4 結(jié)論

采用熒光免疫化學(xué)方法分析ROS在AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs增殖中的作用,發(fā)現(xiàn)AngⅡ能夠促進(jìn)myoFbs增殖并導(dǎo)致MF；表明ROS和p-PKCα在AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs增殖并導(dǎo)致MF過程中發(fā)揮著重要的作用。NAC通過降低·OH的含量和抑制p-PKCα的膜轉(zhuǎn)位和表達(dá)從而抑制myoFbs的增殖和MF。此研究結(jié)果為從ROS-PKCα信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來治療MF和逆轉(zhuǎn)心肌重塑提供了可能的治療靶點。

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（Received 23 April 2015；accepted 18 August2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.30873066/C180102）and the Major State Basic Research Development Program（No.2007CB512006）

Role of Reactive Oxygen Species by Fluorescence Analysis in Proliferation of M yofibroblasts Induced by AngiotensinⅡ

WANG Li-Ying1,SU Hai-Yan2,WANG Xuan1,ZHOU Yan*1,YANG Shi-Jie31（Physiology Department ofBasic Medicine College of Beihua University,Jilin 132013,China）
2（Preventive Health Department of Tumor Hospital of Jilin Province,Changchun 130021,China）
3（Pharmocology Department of Basic Medicine College of Jilin University,Changchun 130021,China）

Fluorescence analysiswas performed to explore the role of reactive oxygen species（ROS）in the proliferation ofmyofibroblasts（myoFbs）induced by angiotensinⅡ（AngⅡ）.Primary cultures of neonatal rat myoFbswere obtained by enzymatic dissociation ofWistar rat neonates,and myoFbswere cultured under 10％ fetal bovine serum.MyoFbs of2-3 generation cultured in vitrowere used in experiments and divided into three groupswhich were treated by AngⅡ,AngⅡ +N-acetyl-L-cysteine（NAC）,and normal culture medium, respectively.MyoFbswere cultured for 12,24 and 36 h.In the experiment,the proliferation rate ofmyoFbs induced by AngⅡ under different concentrations of 3-（4,5）-dimethylthiazo（-z-yl）-3,5-diphenyletrazoliumromide（MTT）was detected,the ROS levels ofmyoFbswere detected by fluorescent probes in 2′, 7′-dichlorofluorescein fluorescence Huang Shuang acetate（DCFH-DA）,and the contents and levels of oxygen free radicals（·OH）in three groups were detected by spectrophotometry,immunocytochemical staining and fluorescence confocal.Immunocytochemical staining and fluorescence confocal analysis was used to measure membrane translocation and expression of p-protein kinase Cα（p-PKCα）.The results showed thatmyoFbs incubated with AngⅡ（10-8-10-6mol/L）for 24 h increased the proliferation rate（the value ofη（％）was 170.15）and ROS,especially the content of·OH（94.53±1.68）reached the highest level.The immunocytochemistry,confocal fluorescence staining and image analysis result showed that AngⅡ could increase the translocation and expression of p-PKCαin membrane（p＜0.001 vs control group）；NAC could inhibit the proliferation of myoFbs induced by AngⅡ （the value ofη（％）was 117.05）,decrease the content of ROS and the levels of·OH（75.57±1.48）,and inhibit the translocation and expression of p-PKCαin membrane.

N-Acetyl-L-cysteine；AngiotensinⅡ；Oxygen free racical；Myofibroblasts；Protein kinase Cα；Reactive oxygen species

10.11895/j.issn.0253-3820.150331

2015-04-23收稿；2015-08-18接受

本文系973重大基礎(chǔ)研究基金資助課題（No.2007CB512006）,國家自然科學(xué)基金項目 （No.30873066/C180102）,博士啟動基金（No.199500033）,吉林市科技計劃項目（No.201536058）資助

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