同位素內(nèi)標(biāo)法測定飼料中氫溴酸常山酮
——超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

王麗娜，王 姝，田曉玲，劉 凱

（1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧省食品藥品監(jiān)督管理局行政服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110016）

同位素內(nèi)標(biāo)法測定飼料中氫溴酸常山酮
——超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

王麗娜1，王 姝2，田曉玲1，劉 凱1

（1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧省食品藥品監(jiān)督管理局行政服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110016）

本研究建立了飼料中氫溴酸常山酮的UPLC-MS/MS分析方法。樣品經(jīng)乙腈提取，離心后經(jīng)正己烷除脂凈化，氮氣吹干后，50%甲醇溶液復(fù)溶，UPLC-MS/MS分析。結(jié)果表明，氫溴酸常山酮在20.0～500.0μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2=0.999 1。以濃縮飼料、配合飼料、預(yù)混料為添加基質(zhì)，其回收率在60%～120%，檢出限為25.0 μg/kg，定量限為50.0μg/kg。結(jié)論顯示，本方法靈敏度高，專屬性好，操作簡單，結(jié)果可靠，可滿足飼料中氫溴酸常山酮的分析檢測。

氫溴酸常山酮；飼料；UPLC-MS/MS

氫溴酸常山酮是由一種植物常山（Dichroa fabrifuga）中獲得的喹唑酮類物質(zhì)，常山酮為較新型的廣譜抗球蟲藥。在國內(nèi)氫溴酸常山酮被允許以3 mg/kg的濃度添加到飼料里，休藥期為4 d。目前，檢測氫溴酸常山酮的方法主要采用液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法[1]，目前關(guān)于檢測飼料中氫溴酸常山酮殘留量的報道較少。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中氫溴酸常山酮含量能夠克服背景干擾，提高信噪比，能夠準(zhǔn)確定性和定量

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC-TQ Detector超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀、氮吹儀（Heros RS-2）、高速離心機（Biofuge STRATOS Centri fuge），Mi ll iQ超純水器（美國Mil l ipore公司）。

1.1.2 對照品 氫溴酸常山酮、氫溴酸常山酮-13C6（對照品均來源于Adlershof GmbH公司），純度≥95.0%。

1.1.3 對照品溶液的配制 分別精密稱取氫溴酸常山酮、氫溴酸常山酮-13C6對照品，以50%乙腈水溶液為溶劑配成濃度各約1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，2～8℃冷藏保存。準(zhǔn)確吸取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用50%乙腈水溶液稀釋成濃度為1μg/mL對照品中間液。

1.1.4 試劑 乙腈（色譜純）；正己烷（分析純）；甲酸（色譜純，純度為99%）；甲醇（色譜純）。試驗用水均為超純水。

1.2 樣品前處理 稱取飼料樣品2 g（準(zhǔn)確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入1μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液100μL（應(yīng)明確內(nèi)標(biāo)工作液的配制方法及濃度)，加入乙腈20 mL，渦旋60 s，10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。加入5 m正己烷，渦旋30 s，10 000 r/min離心5 min。棄去上層，下層溶液50℃氮氣吹干。2 mL 50%甲醇溶液溶解后，加入5 mL正己烷，渦旋30 s，10 00 r/min離心5 min。棄去上層，下層過0.22μm濾膜過濾，上機測定。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件 C18100 mm×2.1 mm，粒徑1. μm?；蚱渌Ч韧腃18柱；柱溫40℃，流動相流速為0.3 mL/min，流動相：A：甲醇；B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～1 min，維持5%A，1～3 min A線性變化至95%，3.5～5 min，維持5%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧正離子掃描（ESI+），毛細管電壓3.0 KV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流速650 L/h，錐孔錐孔氣流速50 L/h，碰撞氣為高純氬氣，光電倍增管電壓650 V。采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測方式，母離子（Q1）/子離子（Q3）離子對見表1。

表1 目標(biāo)化合物的UPLC-MS/MS檢測條件Tab le1 UPLC-MS/MS acquisition param eters for target com pounds

2 結(jié)果與分析

2.1 母離子和子離子的選擇 以甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相[2]，采用MS-Scan模式進行全掃描，確定母離子質(zhì)量數(shù)，優(yōu)化母離子使其獲得較高的豐度。選定母離子后再采用Daughter-Scan方式對其子離子進行掃描，通過優(yōu)化碰撞能量選擇兩個豐度較高的子離子作為定性和定量離子。利巴韋林藥物的離子對、錐孔電壓及碰撞能量的優(yōu)化參數(shù)見表1。

根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，確證利巴韋林至少需要4個識別點（IP），分別選擇了母離子以及對應(yīng)的2個響應(yīng)較強的子離子作為定性定量依據(jù)，這樣1個母離子1個IP點，對應(yīng)2個子離子分別1.5個IP點，達到了4個IP點，很好地滿足了歐盟有關(guān)法規(guī)的要求。

2.2 液相色譜優(yōu)化條件的選擇 氫溴酸常山酮中等極性，容易在反相C18色譜柱上保留[3]。以甲醇和0.1%甲酸水溶液作流動相，在流速為0.3 mL/min的條件下，根據(jù)實驗室條件選用Waters BEH C18、Wa ters HSS T3、Agilent SB-Aq色譜柱，其測得的結(jié)果是，氫溴酸常山酮在Agi lent SB-Aq色譜柱中的保留性差，保留時間短。在Waters BEH C18和Waters HSS T3色譜柱中保留性好，能夠有效避免藥物在死時間出峰，保留時間理想。流動相以0.1%甲酸水為強洗溶劑，以甲醇為弱洗溶劑[4]，減少水相可縮短保留時間，但甲醇可提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。在流動相中加入甲酸可以提高被檢測藥物的離子化效率，提高靈敏度。故試驗選擇1.3.1為試驗液相條件。

2.3 樣品前處理條件的確定 氫溴酸常山酮藥物的提取劑在參考相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上選擇使用甲醇、乙腈2種提取液的提取效果[5]，根據(jù)添加50μg/kg的樣品回收結(jié)果，表明乙腈為提取溶劑時提取回收率高，雜質(zhì)干擾小。

2.4 線性方程、檢出限和定量限 分別精密量取適量1μg/mL的氫溴酸常山酮及內(nèi)標(biāo)溶液，制得濃度為20、50、100、200、500 ng/mL系列對照溶液供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。以對照品和內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，對照溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線方程見表2。

表2 目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab le2 Calibration curves，corre lation coefficient、LOD and LOQ o f target com pounds

2.5 方法的靈敏度 空白試料按相同的步驟處理后，測定結(jié)果表明：在相應(yīng)的保留時間，空白試料對所測分析物無干擾。

圖1 配合飼料定量限圖譜Fig.1 Chromatogram s o f ribavirin spiked at the leve l of LOQ in feeds

檢測限（LOD）與定量限（LOQ）：添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2g空白樣品中，經(jīng)提取凈化后測定，根據(jù)所測藥物的S/N＞3（按PtP算）計算氫溴酸常山酮在配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混合飼料中檢出限為25μg/kg，S/N＞10（按PtP算）計算氫溴酸常山酮在配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混合飼料中定量限50μg/kg，見圖1～3。

圖2 濃縮料定量限圖譜Fig.2 Chromatograms of ribavirin spiked at the level of LOQ in concentrated feeds

圖3 預(yù)混合飼料定量限圖譜Fig.3 Chrom atogram s of Halofuginone spiked at the leve l of LOD in Pre-m ixed feeds feeds

20μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在MRM監(jiān)測模式下的選擇離子流圖，見圖4。

圖4 20μg/m L氫溴酸常山酮對照品溶液圖譜Fig.4 Chrom atogram s of 20μg/m L Halofuginone standards so lution

2.6 方法回收率和精密度考察 由于氫溴酸常山酮在產(chǎn)蛋期飼料中禁止使用，作為藥物飼料添加劑用量為3 mg/kg。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白飼料中（產(chǎn)蛋期）添加濃度50～250μg/kg，在普通飼料中添加濃度為1.5～6 mg/kg的水平范圍內(nèi)進行回收率試驗，各濃度5個樣品平行試驗，平均回收率為60.0%～120%，批內(nèi)批間RSD值均＜20%。計算結(jié)果見表3～8。

表3 空白預(yù)混合飼料（產(chǎn)蛋期）中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTable3 Results o f recovery experim ents and RSD in Pre-m ixed feeds（egg laying period）（n=5）

表4 空白濃縮飼料（產(chǎn)蛋期）中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTable4 Results of recovery experiments and RSD in concentrated feeds（egg laying period）（n=5）

表5 空白配合飼料（產(chǎn)蛋期）中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab le5 Results of recovery experim ents and RSD in feeds（egg laying period）（n=5）

表6 空白預(yù)混合飼料（非產(chǎn)蛋期）中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab le6 Resu lts of recovery experim ents and RSD in pre-m ixedd feeds（n=5）

表7 空白濃縮飼料（非產(chǎn)蛋期）中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab le7 Resu lts o f recovery experim ents and RSD in concentrated feeds（n=5）

表8 空白配合飼料（非產(chǎn)蛋期）中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab le8 Results of recovery experiments and RSD in feeds(n=5)

3 結(jié)論

本研究建立了一種定性與定量測定配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混合飼料中氫溴酸常山酮殘留量的分析方法。此方法穩(wěn)定性強，重現(xiàn)性好，能夠滿足配合飼料、濃縮料、預(yù)混合飼料中氫溴酸常山酮的確證檢測。

[1]李丹，孫雷，畢言峰，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉和牛肉中五種常用抗球蟲藥[J].中國獸藥雜志，2013，47（4）：38-41.

[2]曹瑩，黃士新，沈富林，等.高效液相色譜法測定雞肝組織中的氫溴酸常山酮殘留[J].中國獸藥雜志2004，38（4）：11-13.

[3]候亞莉，湯明，郭利敏，等.鱘魚肌肉中氫溴酸常山酮殘留檢測的高效液相色譜法[J].中國獸藥雜志2006，40（5）：15-18.

[4]吳寧鵬，杜向黨，沈建忠.雞肝臟和肌肉組織中常山酮殘留的ELISA檢測[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2006，37（6）597-602.

[5]李銀生，王秀紅.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞肉或雞蛋中常見抗球蟲類藥物殘留[J].上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2011，29（6）：16-23.

Determ ination of Halofuginone in Feeds by Ultra Perform ance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Wang Lina1,Wang Shu2,Tian Xiaol ing1,Liu Kai1
(1.Animal feed qual ity and safety of venterinary testing centre in Liaoning province,Liaoning Shenyang
110016；2.Liaoningprovincial foodandDrugAdminist rationAdminist rativeServiceCenter,Liaoning Shenyang 110016）

Amethod of Ul tra Per formance Liquid Chromatography-Tandem mass spect romet ry(UPLC-MS/ MS)for determination of Halofuginone in feeds was developed.The samples were extracted with acetonit ri le,cent ri fugated and then degreasing purif ied with n-hexane,dried with nitrogen,dissolved again using 50%methanol solution.Af ter UPLC-MS/MS,the resul ts shows that the l inear relationship is good(r2=0.999 1)when hydrobromic acid Changshan ketone concent ration range is at 20～500μg/L.As the added mat rix with concent rated feed,feed,premix,the recovery rate is 60%～120%,the detection l imit is 25μg/kg,the l imit of quanti f ication is 50μg/kg.Conclusion:this method has the advantages of high sensitivity,good speci ficity,simple operation,reliable resul ts,which can meet the detection and analysis of Halofuginone analysis in feed.

Halofuginone;Feeds;UPLC/MS/MS

S812.6

1672-9692(2015)05-0012-07

2015-03-24

王麗娜（1982-），女，碩士研究生，主要從事獸藥殘留檢測工作。