辣白菜中乳酸菌的分離鑒定

孟令帥，張 穎，鄒婷婷，烏日娜,2，岳喜慶，武俊瑞,*

辣白菜中乳酸菌的分離鑒定

孟令帥1，張 穎1，鄒婷婷1，烏日娜1,2，岳喜慶1，武俊瑞1,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

從沈陽市7 個區(qū)25 份朝鮮族家庭制作的傳統(tǒng)發(fā)酵辣白菜中分離出81 株乳酸菌疑似菌株，初步鑒定34 株為桿菌，47 株為球菌。進(jìn)一步采用16S rDNA序列分析對81 株菌進(jìn)行分子鑒定，通過序列分析進(jìn)行屬種鑒定。結(jié)果表明：81 株菌均為乳酸菌，分別來自2 個屬6 個種，45 株為屎腸球菌，25 株為植物乳桿菌，4 株為干酪乳桿菌，3 株為戊糖乳桿菌，2 株為短乳桿菌，2 株為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌。研究結(jié)果為我國東北辣白菜中乳酸菌作進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

辣白菜；乳酸菌；16S rDNA；同源性分析

辣白菜是韓國、朝鮮和我國東北地區(qū)特有的一種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜食品[1-3]，在我國東北人民飲食中，作為一種非常重要的配菜，至今仍深受消費(fèi)者喜愛。辣白菜的主要原料是大白菜，其制作方式是：先用鹽水將白菜腌制，低溫貯存幾天，然后，將辣椒、大蒜、生姜、魚汁、青梅汁和蜂蜜等配料混勻后，均勻地涂抹于白菜的表面，再將一些水果切片涂抹在白菜的表面，最后經(jīng)過乳酸菌等微生物發(fā)酵而成[4-7]。近年來的研究表明，辣白菜中存在豐富的乳酸菌資源[8-9]，是挖掘有益乳酸菌的寶庫。2012年，Kim等[10]研究發(fā)現(xiàn)，明串珠菌、乳酸桿菌、短乳桿菌以及鏈球菌有助于泡菜發(fā)酵，植物乳桿菌屬和片球菌屬會使泡菜過度酸化。

本實(shí)驗(yàn)試圖通過傳統(tǒng)方法從采集到的25 份辣白菜樣品中分離出乳酸菌疑似菌株，并結(jié)合16S rDNA序列分析技術(shù)，分別對其鑒定，初步探明辣白菜中乳酸菌的構(gòu)成。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

樣品分別采自沈陽市大東區(qū)、東陵區(qū)、皇姑區(qū)、和平區(qū)、鐵西區(qū)、于洪區(qū)以及蘇家屯區(qū)7 個區(qū)不同的農(nóng)貿(mào)市場，共計(jì)25 份辣白菜樣品，所用樣品均為朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵辣白菜。

培養(yǎng)基采用MRS培養(yǎng)基[11]。

20 mg/mL蛋白酶K、RNA酶、正向引物、反向引物、TaKaRa Ex Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP Mix、瓊脂糖、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色液北京鼎國昌盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；無菌操作臺蘇凈集團(tuán)安泰公司；DNP-9080生化培養(yǎng)箱上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-6恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；VS-1渦旋儀北京鼎昊原料科技有限公司；CR-21G離心機(jī)（50 mL）天美科技儀器有限公司；Centrifuge-5418離心機(jī)（1.5 mL）上海艾研生物科技有限公司；PTC-200梯度基因擴(kuò)增儀、瓊脂糖凝膠電泳儀美國伯樂公司；UV-3200分光光度計(jì)上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

應(yīng)用層主要是以數(shù)據(jù)層為基礎(chǔ)，通過調(diào)用數(shù)據(jù)層向上提供的接口，對該層提供的盾構(gòu)運(yùn)行數(shù)據(jù)和特征數(shù)據(jù)進(jìn)行對應(yīng)的加工處理，實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的業(yè)務(wù)邏輯，并向表示層提供接口，將實(shí)現(xiàn)的業(yè)務(wù)邏輯通過表示層可視化表現(xiàn)。如此處于系統(tǒng)中間層的應(yīng)用層是系統(tǒng)核心，起著承上啟下的作用，系統(tǒng)的功能實(shí)現(xiàn)則主要在這層實(shí)現(xiàn)。

1.3.1 辣白菜中乳酸菌活菌數(shù)的測定

采用平板計(jì)數(shù)法，分別對25 個辣白菜樣品中的乳酸菌活菌數(shù)進(jìn)行測定[12-13]。

1.3.2 乳酸菌的分離、純化與初步鑒定

將采集的辣白菜汁樣品用滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，分別接種到含有2%碳酸鈣的固體MRS培養(yǎng)基中，分別在20、37、45 ℃厭氧培養(yǎng)48 h[14]，挑選有鈣圈的菌落，分別劃線分離純化2～3次后，選取單菌落，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，同時進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)純種、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的無芽孢菌進(jìn)行拍照保存[11-17]。

1.3.3 乳酸菌16S rDNA序列鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取對數(shù)生長末期的乳酸菌基因組DNA[18-19]，采用16S rDNA通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增[20-21]，正向引物為27F（對應(yīng)于Escherichia coil 8～27位堿基）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物為1495R（對應(yīng)于Escherichia coil 1495～1515位堿基）：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，由上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 500 bp處有清晰的條帶后測序[22-24]，測序由上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.3.4 乳酸菌同源性分析

利用BLAST分析工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST）將所分離的乳酸菌16S rDNA序列與GenBank/ EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知菌株的對應(yīng)序列進(jìn)行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知菌種[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣白菜中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果

表1 辣白菜中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Lactic acid bacterial counts in kimchi

由表1可知，25 個辣白菜樣品中乳酸菌菌落總數(shù)大約在3.30×108～2.56×1010CFU/mL之間，平均為8.08×109CFU/mL。說明辣白菜樣品中乳酸菌含量較高，對于辣白菜的發(fā)酵可能發(fā)揮著重要的作用。

2.2 辣白菜中乳酸菌的分離與鑒定

2.2.1 辣白菜中乳酸菌的分離與初步鑒定

乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征包括菌落形狀、菌落顏色和菌落透明度等，從25 個辣白菜樣品中初步分離出81 株疑似乳酸菌的菌株，經(jīng)過革蘭氏染色和過氧化氫酶反應(yīng)，81 株菌革蘭氏染色均為陽性，過氧化氫酶反應(yīng)均為陰性。其中，革蘭氏染色結(jié)果為：桿菌34 株，球菌47 株。81 株菌經(jīng)初步鑒定均為乳酸菌。部分代表型乳酸菌菌株的革蘭氏染色鏡檢照片如圖1所示。

圖1 部分代表型乳酸菌的革蘭氏染色圖片F(xiàn)ig.1 Gram staining photos of some representativeLactobacillusstrains

2.2.2 乳酸菌16S rDNA序列鑒定和同源性分析結(jié)果

表2 乳酸菌16S rDNA序列同源性分析結(jié)果Table 2 Homological analysis of lactic acid bacteria by 16S rDNA sequence

由表2可知，從沈陽各地采集的25 份朝鮮族家庭制作的辣白菜樣品中分離到的81 株乳酸菌疑似菌株，經(jīng)鑒定均為乳酸菌，除菌株20HM1-2、37TX2-2、37HX2-1、37SJ1-6、20HX3-1和37HX7-1這6 株菌外，其余75 株菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性均在99%以上，其中，56 株菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性達(dá)到100%。將上述結(jié)果進(jìn)行歸納后可得到表3。

表3 辣白菜中乳酸菌的分布結(jié)果Table 3 Distribution of lactic acid bacteria in kimchi

由表3可知，25 份樣品中分離出的81 株乳酸菌疑似菌株，經(jīng)16S rDNA序列測定和同源性分析鑒定，分屬2 個屬6 個種，分別為E. faecium 45 株，占分離菌株總數(shù)的55.6%；L. plantarum 25 株，占分離菌株總數(shù)的30.86%；L. casei 4 株，占分離菌株總數(shù)的4.94%；L. pentosus 3 株，占分離菌株總數(shù)的3.70%；L. brevis 2 株，占分離菌株總數(shù)的2.5%；E. durans 2 株，占分離菌株總數(shù)的2.5%。E. faecium和L. plantarum是本次分離菌株中數(shù)量最多的菌種，同時大多數(shù)樣品中均分離出了這兩種乳酸菌，因此，可以推斷L. plantarum和E. faecium是本次采集的25 份辣白菜樣品中的乳酸菌優(yōu)勢菌種。

2.2.3 辣白菜中乳酸菌的分離溫度分布分析

從沈陽25 份辣白菜樣品中共分離出81 株乳酸菌，結(jié)合表2對這81株乳酸菌的分離溫度進(jìn)行了對比，結(jié)果見表4。

表4 辣白菜中乳酸菌的分離溫度分布結(jié)果Table 4 Temperature distribution of lactic acid bacteria in kimchi

由表4可知，20 ℃培養(yǎng)條件下共分離出24 株乳酸菌，占所分離乳酸菌菌株總數(shù)的29.63%；37 ℃培養(yǎng)條件下共分離出42 株乳酸菌，占所分離乳酸菌菌株總數(shù)的51.85%；45 ℃培養(yǎng)條件下共分離出15 株乳酸菌，占所分離乳酸菌菌株總數(shù)的18.52%。不同屬種乳酸菌有著不同的最適生長溫度，本次采集的辣白菜樣品中的乳酸菌大多數(shù)最適生長溫度在37 ℃左右。而在20、37、45 ℃培養(yǎng)條件下均分離到了L. plantarum和E. faecium這兩種菌，說明這兩種菌對溫度的適應(yīng)范圍比較廣，并且對溫度的耐受性較強(qiáng)，屬于辣白菜樣品中的乳酸菌優(yōu)勢菌種。屬于低溫型菌種的L. brevis只在20 ℃培養(yǎng)條件下分離得到。屬于中低溫型菌種的L. casei和L. pentosus則在20 ℃和37 ℃培養(yǎng)條件下分離到。由此可知，在不同培養(yǎng)溫度下，分離得到的菌群有一定差異，同一類群菌株在不同溫度培養(yǎng)條件下生長情況也不相同，以上結(jié)果可為以后乳酸菌的分離鑒定提供參考。

3 結(jié)論與討論

國外對韓國泡菜做了較多研究，研究發(fā)現(xiàn)其中蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源。而國內(nèi)對于四川泡菜的研究較多，主要集中于對四川泡菜中乳酸菌多樣性分析、特定功能乳酸菌的篩選等，國內(nèi)外學(xué)者均成功從泡菜中分離鑒定出了不同種類的乳酸菌，表明乳酸菌是自然發(fā)酵泡菜中的優(yōu)勢菌群，并在其發(fā)酵過程中起著重要作用。同時不同地區(qū)和生存環(huán)境采集的樣品中，微生物種類、群落結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性均有差異。我國東北居住著大量朝鮮族居民，至今仍保留著采用傳統(tǒng)方法制作和食用辣白菜等自然發(fā)酵泡菜食品的習(xí)慣，再加上我國東北特有的地理、氣候和環(huán)境特點(diǎn)，我國東北辣白菜現(xiàn)已成為我國一種獨(dú)特的傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜制品。通過采集沈陽25 份辣白菜樣品，并從中分離鑒定出81 株乳酸菌。其中不但分離到了L. plantarum、L. brevis、L. pentosus、L. casei以及E. faecium等國內(nèi)外泡菜研究中發(fā)現(xiàn)的常見菌種，同時也分離到了2株E. durans，這是其他文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道的。

我國東北傳統(tǒng)發(fā)酵辣白菜中蘊(yùn)含著豐富多樣的乳酸菌資源，是我國乳酸菌研究和資源開發(fā)的一個寶庫。與國內(nèi)外類似發(fā)酵泡菜食品相比，我國東北辣白菜中的乳酸菌種類、分布和組成又有獨(dú)特的地區(qū)地域特點(diǎn)，可進(jìn)一步從中挖掘和開發(fā)一些新的或特有的乳酸菌優(yōu)良菌株。

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Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Kimchi

MENG Lingshuai1, ZHANG Ying1, ZOU Tingting1, WU Rina1,2, YUE Xiqing1, WU Junrui1,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Lactic acid bacteria were isolated and identified from 25 Korean traditional fermented kimchi samples from 7 districts of Shenyang. Totally 81 strains suspected of being lactic acid bacteria were isolated successfully, and 34 of the isolated strains were identifi ed as bacilli and 47 were identifi ed as cocci. These 81 strains were further identifi ed by 16S rDNA sequence analysis. The results showed that all these 81 strains were confi rmed as lactic acid bacteria from 2 genus and 6 species, including 45 strains of Enterococcus faecium, 25 strains of Lactobacillus plantarum, 4 strains of Lactobacillus casei, 3 strains of Lactobacillus pentosus, 2 strains of Lactobacillus brevis, and 2 strains of Enterococcus durans. These results can provide a basis for further studies on lactic acid bacteria from kimchi in northeast China.

kimchi; Lactobacillus; 16S rDNA; homology analysis

TS201.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201511025

2014-11-25

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31470538；31370502）；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014M560395）；

遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)資助計(jì)劃項(xiàng)目（2014048）；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目（1402071C）；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)“天柱山英才支持計(jì)劃”項(xiàng)目

孟令帥（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：15040260380@163.com

*通信作者：武俊瑞（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：junruiwu@126.com