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    噬菌體展示技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

    2015-04-09 11:45:56胡雨欣陳力力
    食品科學(xué) 2015年11期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    胡雨欣,何 早,陳力力,劉 霞*

    噬菌體展示技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

    胡雨欣,何 早,陳力力,劉 霞*

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

    噬菌體展示技術(shù)是20世紀(jì)80年代逐步建立并發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)新技術(shù),目前用于構(gòu)建展示文庫的噬菌體主要有絲狀噬菌體、λ噬菌體、T4噬菌體和T7噬菌體。該技術(shù)在篩選噬菌體、單鏈抗體及多肽以建立食品安全檢測(cè)體系方面,具有廣闊的應(yīng)用前景。本文在介紹噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,對(duì)該技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

    噬菌體展示技術(shù);食品致病菌;檢測(cè)

    噬菌體(bacteriophage)是一系列具有感染原核細(xì)胞以完成自身復(fù)制的病毒。噬菌體存在著各種各樣的形態(tài)及遺傳結(jié)構(gòu),因此其在分子遺傳學(xué)中起著歷史性的關(guān)鍵作用。大多數(shù)的噬菌體的寄主范圍是非常有限的,通常只感染單一種類的細(xì)菌[1]。將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到編碼噬菌體衣殼蛋白的基因組中并表達(dá),使目的多肽片段與噬菌體衣殼蛋白形成融合蛋白,同時(shí)外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面,稱之為噬菌體展示(phage display),由Smith[2]于1985年發(fā)現(xiàn)。該項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,隨著沙門氏菌、大腸桿菌等食源性致病菌的污染造成的食品安全事件的發(fā)生,該項(xiàng)技術(shù)也應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)當(dāng)中,目前還處于起始階段。

    1 概 述

    1.1噬菌體展示技術(shù)的原理

    噬菌體展示技術(shù)是一種基因表達(dá)篩選技術(shù),在此過程中噬菌體的衣殼蛋白只是發(fā)揮對(duì)展示肽段的錨定作用,而對(duì)其結(jié)構(gòu)沒有影響;同時(shí),外源多肽的表達(dá)不干擾噬菌體感染和擴(kuò)增的能力,從而達(dá)到特異性分子在同一噬菌體顆粒內(nèi)基因型與表型的統(tǒng)一[3]。這一革命性的技術(shù),是自20世紀(jì)初噬菌體發(fā)現(xiàn)以來最大的革命之一[4]。

    1994年McCarrey等[5]最先構(gòu)建了噬菌體多肽和抗體展示文庫。噬菌體展示文庫(phage display library)是將展示不同特異性抗體片段的一大群重組噬菌體集合在一起,庫中的每個(gè)肽是可以復(fù)制的,當(dāng)噬菌體與靶分子經(jīng)過一段時(shí)間的孵育后,洗脫未結(jié)合的游離噬菌體,用競(jìng)爭(zhēng)受體或酸將與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體洗脫下來,然后對(duì)其進(jìn)一步的擴(kuò)增,再投入下一輪的淘選。經(jīng)過3~5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后,獲得高度富集的與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體。

    1.2噬菌體展示系統(tǒng)的類型

    目前,用于構(gòu)建噬菌體展示系統(tǒng)的載體主要有絲狀噬菌體[2]、λ噬菌體[6]、T4噬菌體[7]和T7噬菌體[8],各系統(tǒng)各具有優(yōu)缺點(diǎn)。

    1.2.1絲狀噬菌體展示系統(tǒng)

    絲狀噬菌體是一個(gè)能夠感染革蘭氏陰性菌的細(xì)菌病毒大家族,具有約為6.5 nm的固定直徑[9],其含有一個(gè)環(huán)狀的單鏈DNA基因組,被包裹于含有幾個(gè)拷貝的主要衣殼蛋白和一些位于頂端的次要衣殼蛋白所組成的有少許柔韌性的管狀衣殼中。與其他的細(xì)菌病毒不同,絲狀噬菌體在所感染的宿主細(xì)菌中的生成和釋放都不會(huì)破壞細(xì)胞或使細(xì)胞裂解。大多數(shù)絲狀噬菌體的信息來源于感染大腸桿菌的噬菌體:f1/M13/fd[2],以及較少范圍的IKE。單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)又分為pⅢ展示系統(tǒng)和pⅧ及其他展示系統(tǒng)。

    1.2.1.1 pⅢ展示系統(tǒng)

    絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒,pⅢ是它的次要外殼蛋白,位于噬菌體的最尾端,是噬菌體感染大腸桿菌所必須的。pⅢ展示系統(tǒng)的最突出特點(diǎn)是對(duì)外源多肽或蛋白的大小無嚴(yán)格限制,較長(zhǎng)的多肽甚至整個(gè)蛋白質(zhì)都可整合到基因外殼蛋白中[10]。pⅢ蛋白在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT 3個(gè)功能區(qū)域,這3個(gè)結(jié)構(gòu)域由兩段長(zhǎng)長(zhǎng)的柔性連接區(qū)域所分隔,連接區(qū)域具有一段富含甘氨酸的連接肽G1和G2[11]。其中,N1為穿膜區(qū),作用于大腸桿菌細(xì)胞膜上的TolA蛋白,與噬菌體的入侵有關(guān);N2為受體結(jié)合區(qū),負(fù)責(zé)結(jié)合大腸桿菌的性菌毛;而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分,并將整個(gè)pⅢ蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端[12-13]。

    1.2.1.2 pⅧ及其他展示系統(tǒng)

    pⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白,位于噬菌體外側(cè),C端與DNA結(jié)合,N端伸出噬菌體外,每個(gè)病毒顆粒約有2 700個(gè)pⅧ拷貝,含有pⅧ的融合蛋白能夠提供多價(jià)展示,從而根據(jù)親和力進(jìn)行目的基因的篩選[14]。pⅧ作為目的蛋白的載體,與pⅢ最顯著的差異在于衣殼蛋白不同的展示效價(jià):在每個(gè)噬菌體表面與pⅢ融合展示的多肽最多可達(dá)到5個(gè),而pⅧ則支持?jǐn)?shù)百甚至數(shù)千多肽的表達(dá)[3]。

    1.2.2λ噬菌體展示系統(tǒng)

    λ噬菌體為20面體噬菌體,結(jié)構(gòu)高度對(duì)稱。其衣殼直徑約為60 nm,殼厚4 nm;可容納48.5 kb基因組[15-16]。λ噬菌體的外殼主要由兩種蛋白質(zhì)構(gòu)成:gpE和gpD[17]。gpD是λ噬菌體頭部組裝必需的蛋白質(zhì),也稱裝飾蛋白。gpE蛋白則負(fù)責(zé)切割DNA以及形成最初的噬菌體頭部[11]。在成熟的噬菌體頭部,其gpD蛋白包含有405~420個(gè)拷貝,當(dāng)插入完整的野生型基因時(shí),頭部組裝蛋白gpD附著于衣殼外側(cè),將噬菌體頭部固定[18-19]。當(dāng)噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時(shí),它可以在缺少gpD的情況下完成組裝[20],故gpD可作為外源序列融合的載體,這種展示一般為N端展示。

    1.2.3 T4噬菌體展示系統(tǒng)

    T4噬菌體是所有噬菌體成員中結(jié)構(gòu)校大的,而且遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜[21],基因組DNA為雙鏈線形,呈環(huán)狀排列。T4噬菌體衣殼由3種必需衣殼蛋白組成,主要衣殼蛋白gp23和2個(gè)次要衣殼蛋白gp24、gp20,衣殼的外表面包裹著兩種非必需蛋白:SOC(small outer capsidprotein)和HOC(highlyantigenic outer capsidprotein),二者相距7 nm,以對(duì)稱的形式分布于噬菌體20面體表面。將外源多肽或蛋白分別與T4噬菌體SOC位點(diǎn)的C末端和HOC位點(diǎn)的N末端融合而展示于T4噬菌體的表面[7,22]。

    1.2.4 T7噬菌體展示系統(tǒng)

    T7噬菌體基因組為線性雙鏈DNA,頭部為20面體,其衣殼蛋白通常有兩種形式,即10A(344個(gè)氨基酸)和10B(397個(gè)氨基酸),正常T7噬菌體的頭部中10A與10B蛋白的比例是9∶1[23],位于噬菌體表面的是10B衣殼蛋白[24]。T7噬菌體展示系統(tǒng)是通過C端融合表達(dá)蛋白,插入片段被克隆到T7噬菌體載體基因10的C端,C端的空間位阻不大[25],即使插入片段內(nèi)含有終止密碼子,也可以被其表達(dá)和展示。

    2 噬菌體展示技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

    食源性致病菌是指可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細(xì)菌。致病菌直接或間接污染食品及水源,人或畜禽感染后導(dǎo)致傳染性疾病的發(fā)生及食物中毒。食源性致病菌主要有致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌、結(jié)核桿菌、布氏桿菌等。檢測(cè)對(duì)象包括細(xì)菌菌群的形態(tài)及細(xì)菌本身、細(xì)菌的DNA及其代謝物等[26]。目前針對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法[27]、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)[28]、免疫學(xué)方法[29]以及生物傳感器[30]的方法。其中免疫學(xué)方法和生物傳感器由于其特異性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便而得到迅速發(fā)展,但這些方法中一般均需要使用抗體,而抗體的獲得主要是通過細(xì)胞雜交瘤技術(shù),需耗費(fèi)大量的時(shí)間和財(cái)力,抗體售價(jià)昂貴、且容易失活。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)為致病菌抗體的制備提供了新的途徑。利用噬菌體展示技術(shù)不僅可以制備對(duì)致病菌具有特異性結(jié)合的噬菌體和單克隆或多克隆抗體,而且可以以單克隆抗體或者單鏈抗體片段(single chain antibody fragment,scFv)為靶分子篩選致病菌的抗原模擬表位[31]。

    2.1篩選噬菌體作為檢測(cè)致病菌的探針

    由于抗體具有價(jià)格昂貴、合成過程復(fù)雜、容易失活等不足,大量的研究已表明可以用噬菌體作為致病菌的診斷探針。早在20世紀(jì)80年代初期,Hirsh等[32]就用Felix-O1噬菌體作為探針檢測(cè)牛奶中的沙門氏菌。他們將Felix-O1噬菌體與沙門氏菌共同培養(yǎng)后獲得與沙門氏菌特異性結(jié)合的噬菌體,并用于樣品中沙門氏菌的檢測(cè),在樣品采集后的8~24 h內(nèi)可獲得檢測(cè)結(jié)果;Bennett等[33]在1997年用該噬菌體作為生物吸附探針從食物中分離出腸炎沙門氏菌,并用于食品中的腸炎沙門氏菌的定量檢測(cè)。2005年Sorokulova等[34]以鼠傷寒沙門氏菌為靶分子,從Landscape噬菌體展示庫f8/8中,對(duì)5輪篩選后的單個(gè)噬菌體進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增和DNA測(cè)序,獲得有效噬菌體序列:VTPPTQHQ,經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunnosorbent assay,ELISA)驗(yàn)證該噬菌體對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有高親和力和特異性,證實(shí)了Landscape噬菌體可以作為分離、診斷和檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的有效探針。

    2.2篩選抗體作為檢測(cè)致病菌的探針

    相比傳統(tǒng)的抗體制備技術(shù),采用噬菌體展示技術(shù)獲得抗體可以避免繁瑣的操作,大大節(jié)約時(shí)間和成本,2007年Nanduri等[35]從構(gòu)建好的Griffin.1文庫[36]中分離噬菌體Lm P4:A8展示的scFv抗體,用于表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)傳感器檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的主要毒力因子——肌動(dòng)蛋白聚集蛋白(ActA),檢測(cè)下限為2×106CFU/mL。同時(shí)通過傳感器獲得了scFv抗體與ActA的解離常數(shù)(Kd)。2010年Singh等[37]利用金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)抗原進(jìn)行生物淘選,得到抗SEB-scFv抗體;用SPR技術(shù)檢測(cè)抗原抗體親和力,并將抗SEB-scFv抗體用于金黃色葡萄球菌食物中毒腸毒素B的血清學(xué)檢測(cè),結(jié)果表明二者具有高特異性且與其他金黃色葡萄球菌毒素?zé)o免疫學(xué)交叉反應(yīng)。2011年Meyer等[38]以鼠傷寒沙門氏菌的外膜蛋白D(outer membrane protein D,OmpD)為抗原,利用噬菌體展示技術(shù)從人類抗體基因庫HAL7中分離重組抗體片段,經(jīng)ELISA驗(yàn)證能夠應(yīng)用于檢測(cè)豬血清中鼠傷寒沙門氏菌的OmpD。Meyer等[39]次年用Hyperphage展示庫,篩選出鼠傷寒沙門氏菌的新型免疫蛋白并成功生產(chǎn)出抗體片段,對(duì)豬血清中的沙門氏菌檢測(cè)具有應(yīng)用前景。

    2.3篩選多肽作為檢測(cè)致病菌的探針

    呈現(xiàn)在噬菌體表面的特異性多肽片段可以提取出來,用于目標(biāo)物的檢測(cè)。Karoonuthaisiri[40]和Morton[41]等從隨機(jī)十二肽庫中篩選出與8種沙門混合菌具有特異性的多肽,并由磁分離技術(shù)驗(yàn)證該多肽作為抗體替代物的可行性;同時(shí),基于篩選得到的噬菌體多肽采用SPR檢測(cè)沙門氏菌,結(jié)果表明該方法具有很高的特異性和準(zhǔn)確性。噬菌體展示技術(shù)篩選的多肽或者抗體可以在幾周的時(shí)間內(nèi)完成,且無需標(biāo)記,因此該方法將為食品致病菌的快速檢測(cè)提供新的思路。Morton等[42]從噬菌體展示肽庫中淘選出單核細(xì)胞增生李斯特菌的多肽,將單核細(xì)胞增生李斯特菌從其他李斯特菌的混合物中分離出來。解決單核細(xì)胞增生李斯特菌缺少獨(dú)特的抗原表位的檢測(cè)難點(diǎn),獲得高特異性的多肽,為食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)提供新的方法。屈瑋等[43]使用NEB公司的噬菌體展示七肽庫試劑盒,對(duì)淘選過程中吐溫的添加量、噬菌體肽庫與阪崎桿菌的結(jié)合時(shí)間、洗脫時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化,篩選可特異性結(jié)合阪崎桿菌的多肽。對(duì)噬菌體克隆的DNA進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明,阪崎腸桿菌的特異結(jié)合多肽序列為QNDGTPR,并用ELISA鑒定出一個(gè)與阪崎腸桿菌特異結(jié)合的陽性單克隆E2,結(jié)果表明E2具有良好的特異性。證明該多肽具有成為阪崎腸桿菌檢測(cè)探針的潛力,可用于阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)。

    3 結(jié) 語

    噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于食品安全檢測(cè),尤其是在篩選特異性的噬菌體、抗體、多肽等時(shí),篩選容量大,克服雜交瘤方法周期長(zhǎng)、復(fù)雜的缺點(diǎn),并且可以大大降低檢測(cè)的成本,節(jié)省人力物力。但由于噬菌體展示技術(shù)可能存在外源性多肽的重疊、肽庫容量的限制性等不足之處,因此,噬菌體展示技術(shù)還有待進(jìn)一步完善。

    目前,噬菌體展示技術(shù)真正用于食源性致病菌的檢測(cè)并不是很多,但是它已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于新型疫苗的研制[44]、醫(yī)學(xué)診斷[45]、多肽藥物研制[46]、抗腫瘤[47]等領(lǐng)域,并且已有不少文獻(xiàn)報(bào)道以陽性單克隆或多克隆抗體為靶分子,從噬菌體肽庫中篩選出抗原模擬表位,用作診斷試劑直接診斷疾病[48]或是生產(chǎn)疫苗[49],這些也可以用于食源性致病菌的檢測(cè)。因此,在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域快速、靈敏、高效的發(fā)展趨勢(shì)下,相信該技術(shù)將來能夠更廣泛地應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)。

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    Phage Display Technology and Its Application in Detection of Foodborne Pathogens: a Review

    HU Yuxin, HE Zao, CHEN Lili, LIU Xia*
    (Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

    Phage display technology is a new molecular biological technology, which was gradually established and developed since the 1980s. Currently there are mainly four types of phages used in the construction of phage display libraries, including filamentous phage,λphage, T4 and T7 phage. This technology has extensive applications in screening specific phages, single-chain antibodies and peptides and establishing food safety detection system. In this article, the system of phage display technology is described, and its application in the detection of foodborne pathogens is summarized.

    phage display technique; foodborne pathogens; detection

    R446.5

    1002-6630(2015)11-0236-04

    10.7506/spkx1002-6630-201511044

    2014-07-03

    公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303084)

    胡雨欣(1990—),女,碩士,研究方向?yàn)槭称钒踩c控制。E-mail:627649521@qq.com

    *通信作者:劉霞(1976—),女,副教授,博士,研究方向?yàn)槭称贩治?,食品營(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail:liuxiaspr@gmail.com

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