CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分子機制及其在人類疾病基因治療中的應用

璩良，李華善，姜運涵，董春升

蘇州大學生物醫(yī)學研究院，蘇州大學醫(yī)學部，蘇州 215123

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分子機制及其在人類疾病基因治療中的應用

璩良，李華善，姜運涵，董春升

蘇州大學生物醫(yī)學研究院，蘇州大學醫(yī)學部，蘇州 215123

CRISPR/Cas系統(tǒng)是廣泛存在于細菌和古生菌中的適應性免疫系統(tǒng)，用來抵抗外來病毒或質粒的入侵。近幾年，由Ⅱ型CRISPR/Cas適應性免疫系統(tǒng)改造而來的CRISPR/ Cas9基因組編輯技術蓬勃發(fā)展，被廣泛地應用于生命科學研究的各個領域，并取得了革命性的變化。文章主要綜述了 CRISPR/Cas9基因組編輯技術的起源與發(fā)展及在生命科學各研究領域的應用，重點介紹了該系統(tǒng)在人類疾病基因治療方面的最新應用及脫靶效應，以期為相關領域的科研人員提供參考。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)；適應性免疫；基因組編輯

基因組編輯技術產(chǎn)生于20世紀80年代，是通過自然狀態(tài)下同源重組(Homologous recombination, HR)途徑對內(nèi)源性基因進行定點敲除或者替換。由于細胞發(fā)生隨機同源重組的效率只有百萬分之一，且耗時長、成本高，因此限制了基因組編輯技術的廣泛應用[1,2]。

21世紀初，科研人員相繼開發(fā)出鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)技術[3,4]和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技術[5～7]，基因組編輯技術得到迅速發(fā)展。細胞內(nèi)有兩種DNA損傷修復途徑：一種是同源介導修復(Homology directed repair, HDR)，可實現(xiàn)準確的DNA修復，不會產(chǎn)生基因突變；另一種是非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)，會產(chǎn)生DNA序列的突變。2013年初，Science、Nature、Biotechnology和Cell等雜志幾乎同時報道了一種不依賴于 FokⅠ核酸酶的基因組編輯技術—Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /associated nuclease 9 (CRISPR/Cas9)，該技術是由細菌或古生菌中的 CRISPR/Cas適應性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來。CRISPR/Cas9核酸酶可以在哺乳動物細胞中進行基因組編輯，實現(xiàn)對靶基因的敲除、突變、插入以及基因抑制和激活等[8～11]。作為一種新的基因組編輯技術，CRISPR/Cas9具有明顯的優(yōu)勢：(1)質粒構建容易，只要向載體上插入一段20 bp的能夠轉錄為sgRNA的DNA片段即可。而ZFN和TALEN在構建表達質粒時，需將多個DNA片段連接后再插入載體中，尤其是TALEN載體的構建，通常需要將7～9段1000 bp以上DNA連接后插入目的載體；(2)操作簡單，在真核細胞中同時表達 Cas9蛋白和靶向目的基因的單導向RNA (Single-guide RNA，sgRNA)，就可以實現(xiàn)對靶基因DNA的編輯；(3)利用CRISPR/Cas9技術可在大部分的細胞和個體中實現(xiàn)基因組編輯，可同時對多個靶點進行修飾，實驗周期短，最快僅需兩個月。本文主要綜述了CRISPR/Cas9適應性免疫系統(tǒng)的分子機制以及在基因組編輯中的應用，特別是在人類疾病基因治療中的應用。

1 細菌 CRISPR/Cas9適應性免疫系統(tǒng)的分子機制

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結構和作用原理

CRISPR是一個特殊的DNA重復序列家族，廣泛分布于細菌和古生菌基因組中。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要分為TypeⅠ、TypeⅡ、Type Ⅲ 3種不同類型。TypeⅠ是CRISPR系統(tǒng)中Cas蛋白種類最多和最復雜的一種，多種Cas蛋白與成熟的crRNA(CRISPR RNA)一起參與外源DNA的降解[12,13]。Type Ⅲ系統(tǒng)中的Cas蛋白是Cas10蛋白，該系統(tǒng)分為A和B兩種類型：A型介導mRNA的降解[14]，B型介導外源DNA 的降解[15]。TypeⅡ系統(tǒng)中只有一種核酸酶—Cas9核酸酶，在該系統(tǒng)中Cas9蛋白與crRNA參與對抗外源噬菌體和質粒的入侵[16,17]。目前，TypeⅡ系統(tǒng)在基因組編輯中應用的最為廣泛。如圖1所示，CRISPR 位點通常由短的高度保守的重復序列組成重復序列的長度通常為 21～48 bp，重復序列之間被26～72 bp 間隔序列(Spacer)隔開[18～20]。CRISPR就是通過這些間隔序列識別外源DNA。Cas系列基因存在于CRISPR位點附近，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9免疫系統(tǒng)依賴 Cas9內(nèi)切酶家族靶向并切割外源DNA[20]，在這一系統(tǒng)中，crRNA 通過堿基配對與tracrRNA(Trans-activating crRNA)結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合物指導Cas9蛋白在特定的位點切割DNA，其中Cas9的HNH核酸酶結構域切割互補鏈，其RuvC-like結構域切割非互補鏈[21]。

近期研究也表明，這樣的雙鏈二元復合體RNA可以被sgRNA所替換，Cas9核酸酶能在sgRNA引導下對靶DNA序列進行切割，它與Fok I酶功能類似，但是并不需要形成二聚體就能發(fā)揮作用[22,23](圖2)。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應對病毒和質粒入侵的免疫機制

病毒或質粒入侵細菌后，其基因組DNA暴露于細菌胞漿之中，CRISPR重復序列轉錄、翻譯出的Cas復合物對外來DNA進行剪切，產(chǎn)生新的spacer序列。如果產(chǎn)生的新spacer序列能夠與CRISPR array內(nèi)部的短重復序列部分互補，將會通過某種未知的方式整合到細菌基因組的CRISPR array 序列中，從而對該病毒或質粒產(chǎn)生特異性免疫記憶[22～25]。當同類的病毒或者質粒再次入侵該細菌時，被插入的新的spacer序列與短重復序列一起融合轉錄為crRNA轉錄的spacer序列可以與病毒或者質粒的DNA進行互補，而與 spacer序列融合的短重復序列可以與tracrRNA部分互補形成 RNA和 RNA復合物，此RNA二元復合物可與 Cas9 核酸酶結合，并引導Cas9核酸酶切割特定互補序列的雙鏈DNA，從而破壞入侵病毒或者質粒的DNA，使其不能在細菌內(nèi)進行復制。具體機制如圖3所示。

圖1 CRISPR/Cas的結構

圖2 CRISPR/Cas9作用原理

圖3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應對病毒和質粒入侵的免疫機制

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用

研究證明Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需利用Cas9核酸酶與sgRNA協(xié)同作用就可以完成對入侵DNA的切割[26]。目前，全世界多個科研團隊相繼證明了CRISPR/Cas9核酸酶可以在線蟲(Caenorhabditis elegans)、斑馬魚(Danio rerio)、果蠅(Drosophila melanogaster)、細菌和酵母等模式生物細胞內(nèi)進行基因組編輯。sgRNA引導Cas9核酸酶在特定的DNA序列進行切割產(chǎn)生雙鏈末端斷裂，細胞可以通過HDR或 NHEJ兩種途徑進行修復，當細胞通過NHEJ途徑進行修復時，在連接處有堿基的缺失與插入，會產(chǎn)生開放閱讀框的移碼突變使靶基因失活，實現(xiàn)基因敲除[27,28]。CRISPR/Cas9技術作為生命科學領域研究技術手段的一個革命性的突破，在構建基因敲除小鼠、遺傳性疾病研究、抗病毒研究、癌癥研究、功能基因篩選、轉錄調控研究、單分子標記研究和基因治療研究等領域中有著廣泛應用。

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯上的應用

CRISPR/Cas9作為最新的基因組編輯技術，最直接的應用就是對靶基因進行精確的編輯。靶向目的基因的sgRNA和Cas9核酸酶在真核細胞內(nèi)共表達，sgRNA可以引導Cas9核酸酶識別靶基因序列并進行切割產(chǎn)生雙鏈末端斷裂 DNA，引發(fā)胞內(nèi) HDR或者NHEJ DNA修復途徑。當細胞內(nèi)轉有目的基因同源臂的外源DNA時，可以通過HDR途徑實現(xiàn)外源基因的敲入[27～31]。最近，中國醫(yī)學科學院張連峰教授利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地將EGFP基因敲入TRDMT1基因座位上[32]。袁晶等[33]運用Cas9基因組編輯技術，對瘧原蟲(Plasmodium)的基因組實行了基因刪除、基因敲入和核苷酸替換。該研究將Cas9質粒、sgRNA質粒與含有同源臂的donor質粒通過電穿孔的方法轉到瘧原蟲的細胞核中，成功地實現(xiàn)了對1.7 kb、4.0 kb和 5.0 kb大小的基因刪除，發(fā)現(xiàn)同源臂越長，基因刪除的效率越高。此外，他們運用類似的方法成功在瘧原蟲PYO3652基因上融合了myc標簽和gfp標記。用此方法可以便于后續(xù)的免疫印跡和免疫熒光等實驗操作，而不需要購買一些昂貴的抗體或耗費大量的時間制備抗體。熒光標記(如GFP, mCherry等)的引入為觀察體內(nèi)細胞顯微條件下蛋白的表達與定位提供了極大的便利。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因治療遺傳性疾病方面的應用

CRISPR/Cas9技術在基因治療遺傳性疾病方面也有著廣泛的應用前景。人類基因組中約有25 000個基因，其中大約3000個基因的突變與人類疾病相關，如血友病、苯丙酮尿癥、囊性纖維病等。CRISPR/Cas9技術可以使基因組中突變的基因失活或者糾正突變的基因，因此可以從根本上治愈這些基因突變導致的遺傳性疾病。2014年，Nature Biotechnology、Science 雜志相繼報道了運用CRISPR/Cas9技術治療FAH基因突變的酪氨酸血癥[31]和杜氏肌營養(yǎng)不良疾病[34]。同年8月5日，Xie 等[35]報道了通過該技術治療地中海貧血癥，該研究者將地中海貧血癥患者的皮膚細胞誘導分化為誘導性多功能干細胞(Inducible pluripotent stem cell，iPSC )，隨后利用CRISPR/Cas9技術修復HBB基因，并將基因修復后的iPSC誘導分化成紅細胞，該紅細胞能夠穩(wěn)定表達正常的HBB蛋白。該研究利用了piggyBac轉座子，因此細胞基因組中沒有插入基因編輯操作所帶的篩選標記。此研究不僅為治療人類地中海貧血癥提供了很好的思路，也為以后干細胞的基因治療提供了一種全新的借鑒方法。2013年，李勁松課題組以小鼠為模型，利用CRISPR/Cas9技術糾正白內(nèi)障模型小鼠受精卵中的 Crygc基因，發(fā)現(xiàn)由該處理組受精卵發(fā)育而來的小鼠的白內(nèi)障癥狀較對照組有了顯著地改善[36]。

2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因治療病毒感染性疾病方面的應用

CRISPR/Cas9技術在治療病毒感染性疾病中也有著良好的應用前景。2013年 11月 14日，Virus雜志上的一篇綜述對CRISPR/Cas9技術用于治療人類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染進行了展望[37]，指出可以將HIV感染者的骨髓干細胞分離出來，運用Cas9基因組編輯技術在體外將HIV-1的宿主細胞輔助受體CCR5或CXCR4基因失活，再將CCR5或CXCR4基因失活的 CD34+造血干細胞回輸給該患者，這些經(jīng)過基因編輯的骨髓干細胞可以分化為產(chǎn)生抵抗HIV-1感染的CD4+T細胞。另外，Kamel Khalili研究小組采取直接靶向HIV-1基因組DNA的治療策略利用CRISPR/Cas9構建靶向HIV-1的LTR U3區(qū)的sgRNA[38]，該sgRNA可以引導Cas9核酸酶識別已經(jīng)整合到HIV-1感染者細胞基因組上的病毒前基因組DNA，并在5′LTR U3區(qū)和3′LTR U3區(qū)進行切割，從而可以從感染者的基因組上切除已經(jīng)整合的病毒前基因組DNA，因而可以抑制HIV-1在體內(nèi)的復制，但是HIV-1前基因組DNA在感染者CD4+T細胞中拷貝數(shù)較多，Cas9核酸酶是否能將CD4+T細胞中整合的病毒前基因組拷貝都切除還有待進一步驗證。

慢性乙型肝炎由人類乙型肝炎病毒(HBV)感染導致，是肝硬化和肝癌的主要誘因之一。HBV的共價閉合環(huán)狀 DNA(cccDNA)對于病毒的持續(xù)性感染起了主要作用。因此，清除被感染肝細胞內(nèi)的HBV cccDNA是臨床上徹底治愈慢性乙型肝炎的關鍵。多項研究表明，CRISPR/Cas9技術可以特異性地靶向HBV cccDNA，從而有效抑制HBV的復制[39～43]Seeger等[42]采用了穩(wěn)定表達 HBV受體 NTCP的HepG2細胞系，然后用HBV去感染該細胞并轉染表達Cas9蛋白和靶向HBV cccDNA的sgRNA，證實Cas9核酸酶的確可以靶向切割 HBV 的基因組cccDNA，并使其通過NHEJ途徑進行修復，引起核苷酸的缺失或插入，從而抑制 HBV 在肝細胞內(nèi)的復制。我們實驗室也成功構建了靶向HBV基因組的 Cas9質粒并證明在細胞和小鼠體內(nèi)能有效清除HBV cccDNA，抑制病毒復制[39]。此外，Suenaga等[44]運用 CRISPR/Cas9技術對單純皰疹病毒(HSV)基因組進行基因組編輯，成功實現(xiàn)了對HSV基因組進行基因敲除與敲入，這些突變后的HSV可以應用于癌癥治療，該研究為其他DNA病毒如EB病毒、巨細胞病毒等的基因組學研究提供了一種新的思路。

2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在癌癥方面的應用

2014年，Torres等[45]首次報道了應用CRISPR/Cas9技術構建癌癥模型的研究，在該研究中Cas9在特異性sgRNA的引導下，在染色體特定位點DNA處進行切割，使被切割的染色體發(fā)生倒位和異位，準確模擬了人類一些腫瘤例如急性髓系白血病和尤文氏肉瘤的形成過程。同年，Xue等[46]運用CRISPR/Cas9基因組編輯技術成功地將抑癌基因p53和pten進行雙突變，構建了肝癌動物模型。Platt等[47]報道了小鼠腫瘤模型，將器官靶向的各種亞型的AAV載體作為CRISPR/Cas9的遞送系統(tǒng)，在肝、腦、肺等器官中實現(xiàn)Cas9核酶的特異性表達，并且成功構建了肺腺癌小鼠模型。由此可見，AAV載體與CRISPR/Cas9技術的聯(lián)合運用將會在癌癥的個體化治療中發(fā)揮越來越重要的作用。

2.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在高通量篩選和功能基因組學上的應用

近來，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)慢病毒介導的功能基因篩選文庫在高通量篩選和功能基因組學的應用取得了很大進展。2014年1月，Shalem等[48]成功構建了由慢病毒介導的靶向 18 080個基因的CRISPR-Cas9 knockout(GeCKO)文庫。他們首先運用GeCKO文庫驗證了腫瘤細胞或多能干細胞生存相關的幾個已知基因，然后又以黑色素瘤為模型，通過該文庫成功篩選了在黑色素瘤發(fā)生過程中幾個關鍵基因，如NF2、CUL3、TADA2B和TADA1。與此同時，Wang等[49]也成功地構建了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的慢病毒sgRNA基因篩選文庫，并通過此文庫證實了DNA錯配修復過程中的所有關鍵基因，而且還發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤藥 etoposide作用的兩個靶基因TOP2A和 CDK6。北京大學魏文勝教授課題組也報道了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的慢病毒sgRNA細胞文庫[50]，并且建立了功能基因篩選平臺以及通過高通量測序技術分析數(shù)據(jù)的一整套技術路線。他們利用這一基因篩選技術，成功鑒定出白喉毒素和炭疽毒素的細胞表面受體，為研究病原菌與宿主相互作用和信號通路提供了極大的便利。

2.6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在研究基因表達調控方面的應用

sgRNA可以引導 Cas9核酸酶識別并切割靶DNA序列，對 Cas9蛋白中具有核酸酶活性的結構域進行突變得到無核酸酶活性的Cas9 (dCas9)，再將其與一個轉錄抑制或者轉錄激活調節(jié)的結構域融合表達，表達的融合蛋白在sgRNA的引導下靶向識別目的基因啟動子區(qū)域，融合表達的轉錄激活結構域或轉錄調節(jié)結構域會招募相關的轉錄因子，從而準確特異地調控靶基因的表達(圖4)。已有報道表明利用此原理建立 CRISPR-ON系統(tǒng)[51]，轉錄激活結構域顯著地激活了IL1RN、SOX2和OCT4報告基因的表達。Qi等[52,53]利用類似的方法在人類細胞和酵母細胞中成功實現(xiàn)了對基因的激活或抑制。在該研究中，他們將這種Cas9介導的抑制細胞內(nèi)基因表達的方法稱為CRISPRi。CRISPRi有以下優(yōu)勢：(1)針對不同的目的基因，只需設計一個 sgRNA即可；(2)可以在同一個細胞中設計多個針對不同基因啟動子的sgRNA，同時研究多個基因的表達、激活或抑制；(3)RNAi作用于翻譯階段，而CRISPR作用于轉錄階段，因此 CRISPR調控基因表達的效率會高很多，作用會更明顯。

2.7 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在活細胞單分子標記領域中的應用

活細胞單分子標記技術是研究細胞內(nèi)單個分子構象變化和動力學的一門前沿技術。2013年，Chen 等[54]將 Cas9核酸酶中具有核酸酶活性的結構域進行突變，使其喪失核酸酶活性，再將失去核酸酶活性的dCas9蛋白與綠色熒光蛋白EGFP融合；在活細胞內(nèi)，靶向染色體端粒重復序列的 sgRNA將dCas9-EGFP引導到端粒區(qū)域，使得染色體末端端粒區(qū)域發(fā)出熒光，借此可以清晰觀察活細胞內(nèi)端粒的延伸與縮短；在此基礎上，他們設計了靶向單拷貝基因MUC4的sgRNA，成功觀察到綠色熒光蛋白基因標記的MUC4基因。由此可見，CRISPR/Cas9系統(tǒng)與單分子標記技術的有效結合，可為研究活細胞內(nèi)染色體和基因的構象和動力學提供一種強大工具。

圖4 Cas9系統(tǒng)調控基因表達的作用機制

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展與展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是靶向基因編輯的一項利器，在構建基因敲除細胞系和基因敲除動物模型、基因治療遺傳疾病和感染性疾病等研究領域有良好的應用前景，但是該技術也存在著一定弊端如脫靶效應，這也是基因治療應用中急需解決的問題之一。脫靶效應會導致基因組中其他序列突變、癌基因激活等不良后果，給臨床應用帶來風險。Duan等[55]通過深度測序分析靶向emx1基因的sgRNA結合位點發(fā)現(xiàn)，除了OT2-1 和OT2-4兩個位點外，大部分脫靶效應位點雖然含有與靶向RNA互補的10～12 bp的種子序列和3 bp的PAM序列(NGG)，但Cas9并不切割這些脫靶位點。研究人員還發(fā)現(xiàn)Cas9核酸酶的脫靶效應具有細胞特異性，他們猜想染色質構象和其他的表觀遺傳因素參與此調控。2013年9月，張鋒課題組通過將Cas9蛋白的核酸酶結構域突變，使得突變的dCas9蛋白只能對靶向DNA的一條鏈進行切割。這樣對于某個基因 DNA雙鏈的切割可以通過設計兩條不同識別序列的sgRNA完成，該策略可使脫靶效應降低1000倍[30]。 隨后，Tsai等[56]和Guilinger 等[57]各自報道了融合蛋白 dCas9-FokⅠ可有效降低CRISPR的脫靶效應。研究人員通過構建表達dCas9-FokⅠ，兩個sgRNA分別引導dCas9-FokⅠ結合到相距15～20 bp的靶DNA區(qū)域，F(xiàn)okⅠ實現(xiàn)二聚化而被激活，對中間的DNA序列進行切割，產(chǎn)生雙鏈末端斷裂。

如何有效地將 Cas9基因組編輯質粒準確地靶向運輸?shù)教囟ǖ募毎?、組織和器官中，實現(xiàn)精確導向的的基因治療[58～62]，也是當今基因治療領域的一大難題。在體外對一些細胞進行基因組編輯，可以用電穿孔或病毒載體將 Cas9基因組編輯質粒轉入細胞之中。電穿孔的方法進行基因轉染對細胞的損傷較大，這些細胞在體外經(jīng)過電穿孔處理后，細胞的活力可能會降低，回輸?shù)襟w內(nèi)后達不到理想的效果。病毒載體如逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體等在體外應用比較廣泛[63～65]。利用慢病毒載體可以使細胞穩(wěn)定、持續(xù)表達 Cas9核酸酶和sgRNA，從而取得較高的基因敲除效率，但也會相對地增加 Cas9核酸酶的脫靶效應；值得注意的是，慢病毒載體在細胞基因組中隨機整合，可能會激活癌基因的表達，在應用于基因治療時不容忽視。在體內(nèi)基因遞送和基因治療應用中，腺相關病毒AAV載體應用十分廣泛。Platt等[47]將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)與AAV系統(tǒng)相結合，成功地對小鼠腦細胞進行了基因編輯，還構建了肺腺癌小鼠模型。也有報道利用AAV遞送Cas9基因編輯系統(tǒng)，成功地對小鼠腦部神經(jīng)細胞的多個基因進行編輯，觀察到了小鼠行為上的變化[66]。除了AAV載體外，納米顆粒和脂質體也是一種充滿前景的遞送工具[67,68]。納米顆?；蛑|體可以包裹按一定比例配制的表達Cas9核酸酶的mRNA和sgRNA, 作為藥物被攝入體內(nèi)。這可以更好地控制服用劑量，并且也極大的降低了機體對于外來刺激的免疫反應。

綜上所述，CRISPR/Cas9基因組編輯技術是生命科學領域一項重要的發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)造，在生命科學研究的領域具有廣泛應用，隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展，其在人類疾病基因治療中必將具有光明的應用前景。

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(責任編委: 謝建平)

The molecular mechanism of CRISPR/Cas9 system and its application in gene therapy of human diseases

Liang Qu, Huashan Li, Yunhan Jiang, Chunsheng Dong
Institutes of Biology and Medical Sciences (IBMS ), School of Medicine, Soochow University, Suzhou 215123, China

CRISPR/Cas system is an adaptive immune system that confers resistance to exogenous virus or plasmid in bacteria and archaea. In recent years, the booming CRISPR/Cas9 genome editing technology modified from typeⅡCRISPR/Cas adaptive immune system has been widely applied to various research fields of life science and led to revolutionary changes. In this review, we summarize the origin and development of CRISPR/Cas9 genome editing technology as well as its applications in life science research. We focus on the latest application of this system in gene therapy of human diseases and the associated side/off-target effects, which may provide references for researchers in related areas.

CRISPR/Cas9 system; adaptive immune system; genome editing

2015-03-16;

2015-07-23

國家自然科學基金項目(編號：K113415011)，江蘇省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(編號：201310285046Z)和蘇州市科技局項目(編號：SYS201452)資助

璩良，本科生，專業(yè)方向：生物技術(免疫工程)。E-mail: quliangsuda@163.com

董春升，副教授，研究方向：免疫學。 E-mail：chunshengdong@suda.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-109

時間:2015-8-4 9:37:07

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150804.0937.004.html