甲狀腺相關(guān)性眼病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

摘要：甲狀腺相關(guān)眼?。?thyroid- associated ophthalmopathy， TAO）是一種器官特異性自身免疫性疾病，為細(xì)胞免疫和體液免疫在遺傳因素、環(huán)境因素條件下共同作用的結(jié)果，居成人眼眶病中發(fā)病率之首。建立一種理想的動(dòng)物模型將為研究 T AO的發(fā)病機(jī)制和治療手段提供良好的平臺(tái)。已有學(xué)者采用人促甲狀腺激素受體活化的脾細(xì)胞免疫同源 BALB/c小鼠建立TAO動(dòng)物模型。到目前為止，各種動(dòng)物模型有其各自的優(yōu)勢和劣勢，從不同模型中獲得的信息遠(yuǎn)大于單一模型。

關(guān)鍵詞：甲狀腺相關(guān)性眼??；動(dòng)物模型；研究方法

甲狀腺相關(guān)性眼病是一種與甲狀腺疾病相關(guān)的器官特異性自身免疫性疾病[1]。在環(huán)境與遺傳因素的相互作用下， 機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了針對促甲狀腺激素受體（ Thyrotropin receptor， THSR ）的抗體（TRAb）。其中，刺激性抗體（TSAb）可模擬TSH 功能，導(dǎo)致甲狀腺激素過度分泌。其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，治療也比較棘手。TAO是一種自身免疫性疾病，而自身免疫性疾病的基本特征之一就是用致敏的淋巴細(xì)胞可使疾病被動(dòng)轉(zhuǎn)移，并能在動(dòng)物身上復(fù)制出與人類自身免疫性疾病相似的動(dòng)物模型[2]。理想動(dòng)物模型的建立向來是深入研究疾病的發(fā)病機(jī)制，探索有效治療措施的途徑之一。本文對 TAO動(dòng)物模型相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。

1 理想的TAO動(dòng)物模型的特點(diǎn)

TAO 各方面表現(xiàn)可通過不同方式誘導(dǎo)。對于一個(gè)理想的 TAO模型，應(yīng)具備如下幾個(gè)或所有特征：①血清中總甲狀腺激素水平升高或促甲狀腺激素水平降低；②存在有活性的促甲狀腺素受體抗體，至少有促甲狀腺激素結(jié)合抑制性免疫球蛋白，即甲狀腺刺激性抗體；③甲狀腺有相應(yīng)的病理改變；④具有甲亢的臨床特征，如體重降低；⑤類似于TAO 的眼部改變，如眼外肌結(jié)構(gòu)的破壞、水腫、淋巴細(xì)胞浸潤和眶脂肪堆積。

眼眶組織的病理檢查發(fā)現(xiàn)：水腫、淋巴細(xì)胞浸潤和黏多糖改變主要發(fā)生在眶脂肪和淚腺組織。這種致突眼方法可能是使大量甲狀腺抗原，包括TSHR釋放入循環(huán)，打破免疫耐受，啟動(dòng)眼眶自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞浸潤和眼眶水腫[3]。此外，高水平的循環(huán)TSH，包括內(nèi)源性的和垂體提取物，都能刺激脂肪形成，導(dǎo)致隨后的眶脂肪堆積。

2 建立TAO動(dòng)物模型的方法學(xué)進(jìn)展

2.1單純TSHR免疫 采用人工合成 TSHR多肽誘導(dǎo)，或用細(xì)菌產(chǎn)生重組 TSHR的融合蛋白，即將 TSHR的胞外區(qū)（ECD）與麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）聯(lián)結(jié)成為ECD-MBP融合蛋白后免疫動(dòng)物；利用桿狀病毒群將TSHR胞外部分的基因轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞，純化后獲得TSHR-ECD多肽，來免疫動(dòng)物。

2.2 TSHR核酸免疫 核酸免疫是使真核細(xì)胞表達(dá)載體克隆出人類 TSHR的全長cDNA ，并將其注入小鼠脛骨前肌中獲得免疫。注射部位的肌肉細(xì)胞攝取cDNA后將蛋白產(chǎn)物表達(dá)于細(xì)胞表面。用含TSH受體cDNA的PBS和25%蔗糖制劑處理 NMR I雜合小鼠后小鼠的血清中均出現(xiàn)TRAb，其中部分雄鼠（9/30）表現(xiàn)為甲狀腺功能減退，部分（4/30）表現(xiàn)為甲亢，同時(shí)出現(xiàn)了類似人類TAO的眼部表現(xiàn)[4]。

2.3表達(dá) TSHR的細(xì)胞免疫 利用表達(dá)人類 TSH受體和鼠 MHCⅡ類抗原分子的纖維母細(xì)胞免疫 AKR /N小鼠。經(jīng)過 11～12w后，多數(shù)小鼠自發(fā)性死亡并伴有甲狀腺腫大。30%～40%實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清甲狀腺激素水平明顯高于對照組，并且在血清中發(fā)現(xiàn)具有刺激甲狀腺活性的TRAb。或用ECD-MBP或核酸免疫活化T細(xì)胞，再將活化的T細(xì)胞移植給同源BALB/c和NOD小鼠，16d后均出現(xiàn)類似于ECD-MBP免疫小鼠的甲狀腺炎，多數(shù) BALB/c小鼠出現(xiàn)類似于TAO的眼眶組織病理學(xué)改變[5]。

2.4 TSAb轉(zhuǎn)基因 TSAb模擬TSH的功能可持續(xù)刺激甲狀腺，是導(dǎo)致甲狀腺激素過度分泌并出現(xiàn)甲亢臨床癥狀的關(guān)鍵。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，來自TAO患者的TSAb經(jīng)過B細(xì)胞克隆后，同樣能結(jié)合 TSHR 并刺激甲狀腺，引起高功能表現(xiàn)。于是，他們把人的 TSAb基因轉(zhuǎn)入小鼠的受精卵中，培育出TSAb 轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果68 %的TSAb 轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)T4升高伴TSH降低，20%T4升高伴TSH正常，T4和TSA b-IgM存在正相關(guān)關(guān)系[6]。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)有高功能分泌的表現(xiàn)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TSA b-IgM-B 細(xì)胞的數(shù)量比預(yù)計(jì)的要低，提示B 細(xì)胞可能自我激活，發(fā)生了克隆剔除，這是免疫耐受的關(guān)鍵。

3 TAO動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

多年來，研究者們嘗試建立TAO的動(dòng)物模型，模擬出TAO的特征如體重減輕、甲狀腺腫等，更重要的是造成其眼球突出。人們認(rèn)為采用接受\"長效甲狀腺刺激物\"如甲狀腺刺激抗體（ TSAB）的方法建立的動(dòng)物模型不被認(rèn)可。隨著對TAO的自身免疫性機(jī)制的逐漸認(rèn)識(shí)，利用甲狀腺軸建立合適的 TAO動(dòng)物模型的方案被認(rèn)為是不可行的。

令人信服的TAO動(dòng)物模型需要應(yīng)用TSHR的克隆技術(shù)以及大量用于免疫反應(yīng)的受體[6]研究者嘗試了很多誘導(dǎo)TAO的動(dòng)物模型，包括用表達(dá)TSHR的B細(xì)胞或人類胚胎細(xì)胞293接種BALB/c鼠；用TSHR-cDNA的質(zhì)粒作為載體接種雜交鼠；用腺病毒作為載體先接種樹突狀細(xì)胞，再接種到BALB/c鼠等。以上嘗試的共同點(diǎn)是均用表達(dá)TSHR的活體載體接種動(dòng)物，以激發(fā)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)；另一個(gè)共同點(diǎn)是均需多次接種才能產(chǎn)生有活性的抗體。最近，研究者用B6B7抗體的可變區(qū)結(jié)合人類IgM的恒定區(qū)培養(yǎng)了TSAb2轉(zhuǎn)基因鼠TAO動(dòng)物模型，其甲亢發(fā)病率達(dá)68%，并具有血T4和TSA b升高、TSH降低、甲狀腺腫大等特征。

目前的各種動(dòng)物模型有著各自的優(yōu)勢和劣勢。Shimojo模型具備很多GD的特征，但是這種模型僅局限于AKR/ N鼠種，并且其高甲狀腺素血癥和TSA b活性僅維持3個(gè)月，相對較短。用TSHR-c DNA的質(zhì)?？梢越臃N不同種類的實(shí)驗(yàn)鼠，并且其脾細(xì)胞可用于記憶T細(xì)胞應(yīng)答性的體外研究，但是這種模型的重復(fù)性差，而且至少在BALB/c鼠種中，其甲亢發(fā)生率相對較低。腺病毒接種的實(shí)驗(yàn)鼠具有和質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)鼠相似的優(yōu)勢，并且在不同試驗(yàn)室間的可重復(fù)性較好，在BALB/c鼠種中甲亢發(fā)生率達(dá)50%，但是在C57BL/6鼠中僅25%發(fā)生甲亢，而在DBA/1J、DBA/2J、CBA/J和SJL/J鼠種中均未發(fā)生甲亢。

關(guān)于建立TAO動(dòng)物模型的方法，Ludgate [7]認(rèn)為以下方法值得推薦：①利用轉(zhuǎn)染了同源的 MHCⅡ類分子的細(xì)胞和人類或鼠類全長的 TSHR免疫AKR/N小鼠；②將TSHR活化的T細(xì)胞傳遞給同源的BALB/c小鼠；③用人類全長TSHR的核酸免疫NMR I雜合小鼠。

4 小結(jié)

綜上所述，目前在建立TAO動(dòng)物模型的探索中已取得了一定的進(jìn)展，但離建立完美的TAO動(dòng)物模型仍有較大的距離。隨著對TAO發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，利用TSHR或其基因以及其他相關(guān)抗原來免疫動(dòng)物的方法被多數(shù)學(xué)者接受。TSAb轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型發(fā)育過程中伴隨了自身免疫的某些機(jī)制，如克隆剔除、對抗原的無反應(yīng)以及對自身抗原耐受的突破，并且轉(zhuǎn)基因模型可進(jìn)行傳代，避免了研究過程中需反復(fù)構(gòu)建模型的麻煩，是一個(gè)全新的方向。TAO動(dòng)物模型主要為鼠類，尚無精確評(píng)估測量活體鼠類動(dòng)物模型的技術(shù)，另外鼠類體型小，缺乏硬性的眶緣，無法測量眼球突出度。Laitt等報(bào)道了吸入麻醉下抑脂 MRI 技術(shù)，可以很清楚地顯示眼外肌和眶脂肪，動(dòng)態(tài)隨訪模型動(dòng)物的眼病變化。建立可供研究與治TAO的合適的動(dòng)物模型還有待于多方面的探索。

參考文獻(xiàn)：

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