Sox9促進間充質(zhì)干細胞向軟骨分化的研究進展

摘要：軟骨損傷修復(fù)是目前臨床治療的難點之一，組織工程學(xué)的應(yīng)用為解決這一難題提供了方向。利用sox9基因轉(zhuǎn)染給間充質(zhì)干細胞（MSCs）使后者向軟骨分化，而獲得穩(wěn)定的軟骨細胞及軟骨組織，為軟骨損傷修復(fù)提供的豐富的軟骨來源。Sox9能激活軟骨細胞外基質(zhì)基因col2a1、col11a2、COMP、蛋白聚糖基因的轉(zhuǎn)錄因子使其過表達，而膠原蛋白I、膠原蛋白II、蛋白聚糖、糖胺多糖等軟骨組織特異性蛋白生成也增加。sox9通過抑制Wnt/β-catenin通路及核心結(jié)合蛋白因子2的活性，增加甲狀旁腺激素相關(guān)肽的表達，抑制軟骨細胞過度生長及骨化，從而維持軟骨形態(tài)及功能。在sox9的機制研究中發(fā)現(xiàn)生長因子、sox5和sox6、機械應(yīng)力、鋅指蛋白145、MicroRNAs等參與sox9的表達及調(diào)控。目前研究者主要利用病毒或非病毒載體系統(tǒng)將sox9基因轉(zhuǎn)染給間充質(zhì)干細胞，促進MSCs向軟骨分化來獲得軟骨來源。在體外的動物實驗中SOX9基因轉(zhuǎn)染后的MSCs發(fā)生了軟骨細胞方向的分化，部分動物體內(nèi)實驗證實轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)干細胞形成了新的軟骨組織。這些實驗結(jié)果提示sox9基因具有應(yīng)用于軟骨修復(fù)的組織工程的潛力及優(yōu)勢，是未來軟骨工程學(xué)的發(fā)展方向之一。

關(guān)鍵詞：sox9基因；間充質(zhì)干細胞；軟骨；分化

軟骨組織具有高度分化、細胞含量少、營養(yǎng)供給少等特點。軟骨組織一旦發(fā)生損害，往往難以完全修復(fù)，故軟骨損傷或缺失的修復(fù)成為臨床治療的難點之一。目前臨床上常用的治療方式主要包括藥物治療及軟骨自體移植，但往往只能達到緩解癥狀的目的[1]。

利用組織工程學(xué)方法修復(fù)軟骨損傷成為目前研究熱點之一。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是目前應(yīng)用最為廣泛的組織工程細胞。它具有分化為骨、軟骨、肌腱、脂肪等組織的多分化潛能，且取材方便，易于培養(yǎng)，自體移植無明顯免疫排斥反應(yīng)，因而被認為是組織工程理想的種子細胞[2，3]。在胚胎時期，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）向軟骨細胞分化并形成透明軟骨組織，在這個過程中，sox9被認為是最為重要的調(diào)控因子[4，5]。因此，近年來研究者設(shè)想在體外和體內(nèi)實驗中利用sox9的調(diào)控機制誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化來獲取豐富的軟骨組織，為軟骨損傷修復(fù)提供軟骨組織來源。

1 Sox9基因

SOX9基因?qū)儆谝粋€帶有特征性HMG-DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子家族（SOX基因家族），可作用于軟骨形成的不同階段，是軟骨形成的必要因素。SOX9基因缺失會導(dǎo)致成軟骨發(fā)育不全[5]。在對成年大鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)SOX9對軟骨組織的生理作用十分必要，當(dāng)SOX9基因受到干擾時，可出現(xiàn)嚴重的Ⅱ型膠原a1鏈（col2a1）mRNA的丟失，引起關(guān)節(jié)壓縮及退行性變[6]。

2 Sox9促進MSCs向軟骨細胞分化的作用機制

在軟骨細胞肥大前，SOX9都是促進軟骨形成的最主要的調(diào)控基因，其作用機制主要有以下幾方面：

2.1 Sox9能在間充質(zhì)干細胞中直接激活細胞外基質(zhì)基因col2a1、col11a2、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）及蛋白聚糖（ACAN）的轉(zhuǎn)錄因子，使其高表達，而這些基因被認為是軟骨標記基因，其表達產(chǎn)物膠原蛋白II、膠原蛋白XI、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白、蛋白聚糖是軟骨基質(zhì)的重要組成成分。同時sox9也能促進其他多種軟骨組織特異性表達的蛋白及多糖的生成，包括膠原蛋白I、糖胺多糖（GAG）、軟骨調(diào)節(jié)素-1、基質(zhì)蛋白3、軟骨連接蛋白（CRTL1）、維甲酸（CD-RAP）等[7-11]。

2.2 SOX9通過抑制Wnt/β-catenin通路[12]及核心結(jié)合蛋白因子2（RUX2）轉(zhuǎn)錄因子[13]而抑制軟骨細胞肥大并繼續(xù)骨化，對維持軟骨形態(tài)及功能起到非常重要的作用。這一作用機制也是后來研究者選擇sox9作為誘導(dǎo)MSCs向軟骨分化的重要原因之一。

2.3 甲狀旁腺激素相關(guān)肽（PTHrP）被認為是促進軟骨增殖同時抑制軟骨細胞肥大及繼續(xù)骨化的重要因子之一[14]。Sox9能直接與PTHrP基因的啟動子結(jié)合，使其活性增加；同時還能與印第安刺猬蛋白/膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2（Ihh/Gli2）通路協(xié)同作用，使得PTHrP表達增加[15]。提示PTHrP可能是sox9抑制軟骨細胞肥大并骨化過程的必要的下游因子之一。

3影響Sox9促進MSCs向軟骨分化作用的因子

Sox9的表達及功能與軟骨形成并不存在嚴格的量效相關(guān)性，提示存在其他因子與sox9協(xié)同作用并促進軟骨形成[16]。

3.1 sox5和sox6 sox5和sox6在軟骨形成過程中具有重要作用，它們能協(xié)同sox9作用于軟骨形成及維持軟骨形態(tài)的過程。其協(xié)同作用的機制可能是Sox5和sox6能促使sox9與它作用區(qū)域結(jié)合更為穩(wěn)定和高效[16，17]。如Sox9能直接與蛋白聚糖基因的一個關(guān)鍵的啟動子結(jié)合，而L-Sox5/Sox6能與蛋白聚糖基因的另外三個具有協(xié)同作用的組分結(jié)合，從而促進蛋白聚糖的表達[17]。

3.2生長因子 TGF-β及其通路是促進MSCs向軟骨細胞分化必要因素之一，其中Smad3和p300能夠在染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平協(xié)同促進sox9的轉(zhuǎn)錄功能[17，18]。BMP-2在促進間MSCs向軟骨細胞分化過程中能有效提高SOX9的表達，并存在量效關(guān)系，其作用機制可能是BMP作用于sox9基因的啟動子CCAAT序列而促進sox9的表達增加[19]。類胰島素生長因子1（IGF-1）能促進II型膠原蛋白的合成，然而在抑制SOX9作用后，IGF-1的這種作用也受到抑制，提示IGF-1通過作用于sox9來促進II型膠原蛋白的形成[20]。

綜上，可以提示sox9基因可能是這些生長因子促進MSCs向軟骨細胞分化的必要的下游因子之一。因此理論上利用SOX9誘導(dǎo)MSCs向軟骨細胞分化，可以減少作用通路的長度，降低干擾，增強作用效能。

3.3 MicroRNA MicroRNA是一類長度約20-24個核苷酸的小RNA片段，一些miRNAs通過直接或間接調(diào)控sox9基因的表達來調(diào)控軟骨的形成。其中負向調(diào)控因子主要包括：miR-140-5p和miR-140-3p[21]、MicroRNA-145[22]、 MiR-194[23]、 MiR-574-3p[24]；正向調(diào)控因子主要包括：miR-335-5p[25]、MiR-23b[26]。

3.4機械刺激 循環(huán)拉伸應(yīng)變能改善sox9與其DNA作用位點的親和力，增加COL2A1的表達[27]。在sox9轉(zhuǎn)染的人間充質(zhì)干細胞中，機械刺激能協(xié)同促進糖胺多糖的表達，同時軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的表達增加，后者只在軟骨組織中表達[28]。從而間接表明機械刺激能促進sox9作用于間充質(zhì)干細胞，從而促進MSCs向軟骨分化。

另外鋅指蛋白145（ZNF145）[29]/前脂肪細胞因子-1（preadipocyte factor1，Pref-1）[30]等也具有促進SOX9在MSCs向軟骨分化過程中的調(diào)控作用。

4 sox9應(yīng)用軟骨組織工程學(xué)的動物體內(nèi)外實驗

4.1動物的體外實驗 HirokiTsuchiya首次嘗試利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將sox9基因轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)中膠原蛋白II及蛋白聚糖的表達明顯增加。之后他們將轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細胞植入無胸腺小鼠的關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白II及蛋白聚糖含量明顯增加的白色軟骨組織形成，并能在缺損軟骨中長期存在[31]。這一實驗提示sox9基因應(yīng)用于軟骨修復(fù)的可能性。Toshiyuki Ikeda成功將sox5，sox6及sox9轉(zhuǎn)入間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞等細胞中，獲得穩(wěn)定的軟骨細胞及周圍細胞基質(zhì)，膠原蛋白II、COMP、ACAN基因過表達， 糖胺多糖、蛋白聚糖及多糖合成明顯增加，從基因及蛋白水平進一步證實sox9的過表達促進了間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化[32]。陽離子聚合物聚醚酰亞胺改良的PLGA（聚乳酸-羥基乙酸共聚物）顆粒的應(yīng)用，提高了sox9基因轉(zhuǎn)染給人骨髓間充質(zhì)干細胞的轉(zhuǎn)染效率，達到了75%[33]。之后這些研究者用同樣的載體，將sox5、sox6、sox9同時轉(zhuǎn)染給人的骨髓間充質(zhì)干細胞， 發(fā)現(xiàn)較單獨轉(zhuǎn)染sox9或者其他任意兩個組合基因，實驗組的膠原蛋白II、COMP、ACAN等軟骨標記基因過表達量更高， 糖胺多糖、蛋白聚糖、膠原蛋白、多糖等成分表達也更為明顯[34]。

4.2動物的體內(nèi)實驗 曹磊等利用腺病毒將sox9轉(zhuǎn)染給兔的骨髓間充質(zhì)干細胞，再將含有轉(zhuǎn)染sox9后的兔骨髓間充質(zhì)干細胞的PGA支架植入兔的全層軟骨損傷的部位。得到較好的修復(fù)效果：新的軟骨細胞及透明軟骨特異性的細胞外基質(zhì)形成，以及軟骨形成的標記基因的過表達[35]。

Magali Cucchiarini利用重組腺病毒作為載體將sox9應(yīng)用于兔體內(nèi)軟骨缺損的修復(fù)，發(fā)現(xiàn)sox9轉(zhuǎn)然后的間充質(zhì)干細胞能在體內(nèi)長期存在，形成新的軟骨細胞及軟骨基質(zhì)，并且抑制分化的軟骨細胞繼續(xù)肥大、骨化，同時還能改善軟骨下方骨的結(jié)構(gòu)[36]。

5展望

Sox9作為軟骨形成及維持軟骨形態(tài)功能的主要調(diào)控因子，將其應(yīng)用于軟骨工程學(xué)將是未來軟骨損傷修復(fù)的重要的方向之一。利用間充質(zhì)干細胞中sox9基因的過表達，使得軟骨標記基因膠原蛋白II、COMP、ACAN基因過表達，相應(yīng)蛋白及軟骨基質(zhì)主要成分的大量生成，促進轉(zhuǎn)染后間充質(zhì)干細胞向軟骨分化。同時sox9基因的過表達能抑制軟骨細胞繼續(xù)肥大并骨化，從而獲得豐富且穩(wěn)定存在的軟骨組織。在體外的動物實驗中SOX9基因轉(zhuǎn)染后的MSCs發(fā)生了軟骨細胞方向的分化，部分動物體內(nèi)實驗證實轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)干細胞形成了新的軟骨組織，并能在體內(nèi)長期存在。這些實驗結(jié)果提示sox9基因具有應(yīng)用于軟骨修復(fù)的組織工程的潛力及優(yōu)勢，為未來在人體軟骨損傷修復(fù)應(yīng)用sox9提供了實驗依據(jù)。

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