大鼠酒精性心肌病心肌超微結構及血清TNF—α和MDA的變化及意義

摘要：目的 研究大鼠酒精性心肌?。ˋCM）心肌超微結構及血清TNF-α和MDA的變化及意義。方法 采用灌胃法制備大鼠酒精性心肌病模型，模型組用40%酒精8g/（kg.d）分二次灌胃共12w，對照組灌等量的生理鹽水，實驗第8、12w末分批處死動物。用光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察大鼠心肌超微結構，測量血清TNF-α和MDA的變化。結果 與對照組相比模型組模型組可見大鼠心肌病變及炎性細胞浸潤及血清TNF-α和MDA的變化。結論 長期攝入酒精可引起大鼠酒精性心肌病，TNF-α和MDA在酒精性心肌病過程中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：酒精性心肌??；腫瘤壞死因子；丙二醛；電子顯微鏡；大鼠

酒精性心肌?。╝lcoholic cardiomyopathy （ACM））是指由于酒精長期攝入過量而導致的心肌損害等一系列病變。細胞變性、死亡是導致許多心臟疾病終末期表現和衰竭的重要機制，一些研究初步證實酒精導致細胞變性和死亡[1-3]。其原理可能是免疫反應和酒精直接損害心肌細胞是造成ACM的主要因素，對ACM的發(fā)生發(fā)展起著十分重要的作用。ACM的心肌損傷程度主要取決于細胞因子，這些因子包括TNF-a、MDA 等。

1 資料與方法

1.1一般資料 雄性Wistar大鼠由延邊大學醫(yī)學院動物科提供，體重為（180±10）g。利用放射免疫分析法檢測血清TNF-a的水平，用硫代巴比妥酸（TBA）法測定血清丙二醛（MDA）的含量。

1.2大鼠ALD模型制造和取材 Wistar大鼠隨機分為兩組，模型組44只給予40%酒精（8g/kg.d）分二次灌胃共12w，對照組22只給予等量的生理鹽水灌胃。實驗第8，12w末分別處死22只動物，心臟采血，取心臟 一部分10% 中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。另一部分用4%戊二醛保存送電鏡室作電鏡標本，試驗模型參照文獻[4]。

1.2血清TNF-a的測定

1.2.1試劑配制 ①125I-TNF1瓶（凍干品）：低溫保存，用前加緩沖液100ml；②TNF抗體1瓶（凍干品）：用前加緩沖液12ml；③TNF標準品5瓶（凍干品）：用前每瓶加緩沖液1.5ml，其濃度為：0.3， 0.9， 2.7， 8.1， 24.3ng/ml；④免疫分離試劑1瓶（懸浮液）：用前充分搖勻；⑤緩沖液1瓶。

1.2.2將-70°保存的血清恢復至室溫。復融混勻，4℃3000rpm離心，取上清液測定。

1.2.3測定 采用平衡法，取聚苯乙烯試管編號，按表1操作。

1.2.4計算結果 由自動γ計數器預先編制程序，直接給出有關參數，標準曲線及樣品濃度。

1.3丙二醛的測定 原理：過氧化脂質降解產物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合形成紅色產物，在532nm處有最大吸收峰。方法：血清中MDA測定按下列步驟進行，見表2。

按下列公式計算：

MDA含量（nmol/ml）=■×標準品濃度（10nmol/ml）

×樣本測試前稀釋倍數

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件計量資料用均數±標準差（x±s）表示，P<0.05為提示兩者之間有顯著性差異。

2 結果

2.1一般情況 對照組大鼠毛發(fā)光量，動作靈活，食欲和大便正常，無溏便；模型組大鼠隨著進食酒精的時間延長，毛發(fā)越無光澤，食欲減退，體重增長緩慢，數只大鼠先后出現溏便。在白酒灌胃后，出現精神萎靡，行動遲緩，上述現象可于3～4h后緩解。

2.2心臟肉眼觀察 模型組心臟心外膜下可見白色點狀、條索狀或斑塊狀病灶，隨著進食酒精的時間延長，癥狀逐漸加重。

2.3心肌組織病理改變 8w模型組可見心肌局灶性變性壞死，伴淋巴細胞或單核細胞浸潤，部分可見壞死灶；12w可見較多心肌壞死病灶，可見程度不等的纖維化。

2.4心肌病變的電鏡觀察 模型組可見線粒體腫脹，嵴斷裂甚至空泡樣變，肌漿網擴張，肌絲溶解斷裂，肌原纖維破壞，并可見淋巴細胞或單核細胞浸潤。

實驗8w末模型組血清TNF-a，MDA值升高與對照組比較差異顯著（P<0.05），12w末模型組TNF-a，MDA值進一步升高與對照組存在顯著性差異（表3）。

2.5血清TNF-a的變化： 模型組血清TNF-a水平與對照組相比經統(tǒng)計學分析有顯著的差異（P<0.05 見表3）。

2.6模型組大鼠血清MDA含量和對照組相比明顯增高，經統(tǒng)計學分析兩組之間有顯著的差異（P<0.05），并與TNF-a水平之間也有相關性（r=0.465， P<0.05）。

3 討論

酒精是一簡單的碳水化合物，飲用后以單純擴散方式很快吸收，濃度越高吸收越快。整個胃腸道均能吸收酒精，但以小腸吸收為主，腦、肝臟、心臟是酒精作用的主要靶器官。在體內，酒精首先代謝為毒性產物乙醛，后者在肝臟中很快被其脫氫酶氧化成乙酸鹽，因而難以在體內蓄積。乙酸鹽轉運出肝臟外組織中進一步代謝。由于酒精能誘導酒精代謝酶的產生因而短期飲酒即能使人和動物產生耐受現象，表現為作用下降或作用時間縮短。

TNF-α可能通過誘導心肌細胞內乙醇代謝相關酶的活性，加強乙醇代謝，從而導致心肌細胞缺氧、損害，伴隨心肌細胞內過氧化反應加強，抗過氧化能力的消弱。TNF-α具有直接的心肌損傷作用，它與心肌細胞膜上的TNF受體結合進入心肌細胞內，與線粒體等細胞器結合，激活某些蛋白酶并使磷脂酶A活性升高，自由基生成增加，引起心肌細胞膜結構被破壞，導致心肌細胞變性壞死。TNF-α通過負性肌力作用、誘導心室重塑、促發(fā)心肌細胞凋亡、介導CHF惡病質的發(fā)生等多種途徑參與了CHF的發(fā)生和發(fā)展[5]。

自由基是指最外層軌道上有未配對電子的原子、分子、離子或基團，其化學活性高，不穩(wěn)定，具有較強的氧化能力。研究證實，自由基廣泛存在于各種生物體系中。自由基與人類疾病關系密切，正常情況下體內存在消除自由基的各種酶類和非酶類系統(tǒng)，使自由基的產生和清除處于相對平衡狀態(tài)。當這種平衡一旦失調時導致自由基含量增加，引起機體新陳代謝紊亂及一系列自由基鏈鎖反應加劇，導致RNA、DNA、蛋白質、酶和生物膜的氧化和過氧化損傷，從而引起多種病理過程和疾病的發(fā)生。乙醇、內毒素、炎性反應、免疫損傷等因素均可使體內氧自由基產生過多，自由基可損傷心肌細胞，引起細胞結構和功能的破壞。人體攝入的90%以上乙醇在肝內主要通過ADH、MEOS、過氧化物酶等代謝途徑氧化，其代謝產物乙醛及MDA與多種機體蛋白結合導致其蛋白的結構改變，功能發(fā)生障礙引起心肌損傷[1，5，6]。細胞漿和線粒體內谷胱甘肽的衰竭程度決定細胞是發(fā)生壞死還是凋亡。實驗組大鼠血清MDA的含量較對照組明顯增高（P<0.01），表明長期攝入酒精可使體內氧自由基產生增多，發(fā)生了明顯的過氧化反應。

本實驗結果表明血清MDA和TNF-a同心肌損害的相關性與文獻報道一致[1，5]。進一步證實其在ACM形成的過程中起重要作用。

參考文獻：

[1]Sharma R， Al-Nasser FO， Anker SD， et al. The importance of tumor necrosis factor and lipoproteins in the pathogenesis of chronic heart failure.Heart Fail Monit，2001，2：42-47.

[2]Rodriguez DA， Moncada C， Nunez MT， et al. Ethanol increases tumor factor-alpha receptor-1 levels in hepatic，intestinal，and cardiac cells.Alcohol，2004，33：9-15.

[3]Chen DB， Wang L， Wang PH. Insulin-like growth factor Ⅰretards apoptotic signaling induced by ethanol in cardiomyocytes.Life Sci，2000，67：1683-1693.

[4]Wang YN， Liu RL， Cheng XZ. Study of alcoholic poisoning model in rats.Chin J Rehabil Theory practice，2006，12：319-320.

[5]Mann D L. Recent insights into the role of tumor necrosis factor in the failure heart[J]Heart Fail，2001，6：71.

[6]Arteel GE.Oxidants and antioxidants inalcohol-induced liverdisease.Gastroenterology，2003，124：778-790.

編輯/哈濤