超氧化物歧化酶在Hcy誘導(dǎo)的THP—1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中的抗氧化作用

摘要：目的 探討超氧化物歧化酶（SOD）在Hcy誘導(dǎo)的THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。方法 THP-1單核細(xì)胞，加入佛波酯（PMA）誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，然后加入100μmol·L-1的 Hcy 和100μmol·L-1 Hcy+葉酸+VB12，并設(shè)置對(duì)照組（0μM Hcy），孵育48h后收集細(xì)胞。采用Fe3+還原比色法檢測(cè)總抗氧化能力（T-AOC）、黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性及硫代巴比妥酸比色法測(cè)定MDA含量。結(jié)果 100μmol·L-1 Hcy組與對(duì)照組比較，T-AOC、SOD水平明顯降低，MDA的含量明顯升高；與100μmol·L-1Hcy+葉酸+VB12組比較，T-AOC、SOD水平升高，MDA的含量降低。結(jié)論 Hcy可誘發(fā)THP-1單核源性巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，SOD的活性下降且與MDA呈負(fù)相關(guān)，表明SOD在Hcy誘導(dǎo)的THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中的抗氧化作用下降。

關(guān)鍵詞：超氧化物歧化酶；同型半胱氨酸；THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞；氧化應(yīng)激；動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種多因素誘導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，在其眾多的致病因素中，氧化所致的損傷與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同型半胱氨酸（Hcy）已被大量臨床及循證醫(yī)學(xué)證實(shí)是AS的一個(gè)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，Hcy致AS的確切機(jī)制仍然有待闡明，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與Hcy致氧化應(yīng)激毒性損傷有關(guān)。正常情況下，隨著氧化代謝效率的提高，體內(nèi)的抗氧化能力也不斷增強(qiáng)，人體已經(jīng)形成較為完善的抗氧化體系，即機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)在某些因素的作用下這種平衡被打破，就形成了氧化應(yīng)激。在機(jī)體抗氧化機(jī)制的研究中，超氧化物歧化酶（SOD）作用的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。SOD催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，作為氧自由基清除的第一反應(yīng)過(guò)程，在阻止自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)機(jī)體的損害方面起關(guān)鍵性作用。因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞，探討SOD在Hcy誘導(dǎo)的THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞氧化損傷中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料 THP-1單核細(xì)胞株來(lái)源于四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院；RPMI-1640培養(yǎng)基為GIBCO 公司產(chǎn)品；小牛血清，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料研究所；同型半胱氨酸（Hcy）、葉酸、維生素B12、佛波酯（PMA）為Sigma公司產(chǎn)品；總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1單核細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇好的THP-1單核細(xì)胞接種于15%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，傳代。以4×106密度接種于25cm×25cm培養(yǎng)瓶，加入PMA使其終濃度為500μmol·L-1（含7%胎牛血清）孵育48h，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，證實(shí)THP-1細(xì)胞已誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 當(dāng)貼壁的THP-1巨噬細(xì)胞密度達(dá)到1×106/mL時(shí)分別加入100μmol·L-1的 Hcy 和100μmol·L-1 Hcy +葉酸+VB12，并設(shè)置對(duì)照組（0μM Hcy），孵育48h后檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)。

1.2.3培養(yǎng)細(xì)胞的收集、破碎及蛋白濃度的測(cè)定 用橡皮刮子刮下孵育后的THP-1巨噬細(xì)胞，1000rpm/min，離心10min棄上清，1mlPBS輕輕吹打，再次1000rpm/min，離心10min棄上清，重懸于0.5ml緩沖液中。功率300W，冰水浴，每3～5s超聲一次，間隔4次。上述樣本用凱基BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，用于計(jì)算。

1.2.4氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）等指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以x±s表示，組間兩兩比較用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)間比較采用Student's t 檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1單核細(xì)胞誘導(dǎo)前后形態(tài)學(xué)變化 THP-1單核細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞呈圓形，透亮，大小均一，形態(tài)規(guī)則，胞膜完整見(jiàn)（圖1）。經(jīng)PMA誘導(dǎo)48h后，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，由圓形變?yōu)橛袀巫愕牟灰?guī)則形狀的巨噬細(xì)胞見(jiàn)（圖2）。

圖1 THP-1單核細(xì)胞（400×） 圖2 THP-1巨噬細(xì)胞（400×）

2.2 THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞T-AOC、SOD及MDA水平改變 THP-1巨噬細(xì)胞分別用100μmol·L-1的 Hcy 和100μmol·L-1 Hcy+葉酸+VB12干預(yù)，檢測(cè)各組細(xì)胞中T-AOC、SOD及MDA的水平（圖3）。結(jié)果顯示，100μmol·L-1Hcy組與對(duì)照組比較T-AOC、SOD水平顯著降低（P<0.05），MDA的含量顯著升高（P<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與100μmol·L-1 Hcy + 葉酸+VB12組比較，T-AOC、SOD水平升高，MDA的含量降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 Hcy干預(yù)THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞T-AOC、SOD及MDA的含量

3討論

Hcy是一類含硫氨基酸，為體內(nèi)蛋氨酸和半胱氨酸代謝過(guò)程中的一個(gè)重要中間產(chǎn)物，在具有AS早期病變的患者中30%患者有高Hcy（HHcy）血癥，HHcy血癥致動(dòng)脈粥樣硬化的病理機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)[1]，其中促進(jìn)超氧化物和過(guò)氧化物的產(chǎn)生，加重體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度所致的損傷不容忽視。大量基礎(chǔ)及臨床研究認(rèn)為，氧自由基參與了心血管疾病發(fā)生、發(fā)展。SOD是人體內(nèi)重要的抗氧化活性物質(zhì)，它可以清除人體代謝中不斷產(chǎn)生的自由基，保護(hù)機(jī)體組織免受自由基和過(guò)氧化損傷。在各種氧自由基中，活性氧對(duì)血管毒性最大，脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物丙二醛（MDA）被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。Cavalca[2]等亦發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在冠心病中明顯加強(qiáng)，而且游離MDA在不穩(wěn)定型和穩(wěn)定型心絞痛患者間有明顯差別。本研究結(jié)果顯示：100μmol·L-1Hcy組的T-AOC、SOD水平明顯降低，MDA的含量明顯升高，抗氧化系統(tǒng)酶活力下降，巨噬細(xì)胞抗氧化能力減弱，提示Hcy促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激可能是其導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)：100μmol·L-1 Hcy+葉酸+VB12組，與100μmol·L-1Hcy組比較，T-AOC、SOD水平升高，MDA的含量降低，說(shuō)明葉酸和VitB12在Hcy誘導(dǎo)的THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞氧化損傷中的有拮抗作用，這與相關(guān)的臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致。文獻(xiàn)報(bào)道[3，4]葉酸、VB12干預(yù)可降低血漿Hcy濃度，減少動(dòng)脈SMTI，可改善HHcy導(dǎo)致的氧化應(yīng)激狀態(tài)。因此，適量葉酸、VB12具有一定程度的抗HHcy導(dǎo)致AS的作用，但尚需有待進(jìn)一步研究。

總之，THP-1單核源性巨噬細(xì)胞在Hcy的作用下，SOD的活性下降且和MDA呈負(fù)相關(guān)，表明SOD保護(hù)作用下降，脂質(zhì)氧化損傷程度增加。反之，則說(shuō)明SOD能夠在一定范圍內(nèi)清除由Hcy刺激THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的氧化物質(zhì)，從而降低細(xì)胞的氧化損傷，為預(yù)防和治療AS提供新的作用靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/申磊