外周血淋巴細(xì)胞染色體制備影響因素探討

摘要：目的 通過對不同培養(yǎng)時間及秋水仙素處理條件、滴片高度等進行比較，建立本室較成熟的外周血淋巴細(xì)胞染色體制備技術(shù)。方法 隨機選擇5例待測外周血淋巴細(xì)胞染色體患者作為實驗對象，采集肝素抗凝靜脈全血2ml，各接種4瓶，其中培養(yǎng)時間分別為62h、70h，秋水仙素處理條件為1h（終濃度0.2？滋g/ml）、3h（終濃度0.08？滋g/ml），滴片高度為2cm、10cm和30cm。計算不同處理條件下的細(xì)胞分裂指數(shù)，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果 培養(yǎng)62h和70h均可獲得較多分裂相，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；秋水仙素處理3h（終濃度0.08？滋g/ml）的分裂相比處理1h（終濃度0.2？滋g/ml）明顯增多（P<0.05）；3種滴片高度均可獲得染色體分散良好的分裂相。結(jié)論 外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)過62～70h培養(yǎng)及0.08？滋g/ml秋水仙素處理3h后，可獲得良好的染色體分裂相，滴片高度對染色體的分散無影響。

關(guān)鍵詞：淋巴細(xì)胞；培養(yǎng)；秋水仙素；染色體

為減少出生缺陷、提高人口素質(zhì)，我國目前已經(jīng)廣泛開展染色體分析技術(shù)，其中外周血淋巴細(xì)胞染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的重要組成部分，同時也是研究染色體與臨床疾病關(guān)系的重要手段。由于本實驗操作過程比較繁瑣，影響因素很多，各地方的染色體制備效果也略有不同。故為提高本院細(xì)胞遺傳室染色體的分析效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性，通過對外周血淋巴細(xì)胞染色體制備過程中的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行探討，以建立適合本實驗室的較為成熟的染色體制備方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年11月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診就診擬行外周血染色體檢測的患者5例，采集肝素抗凝靜脈全血2ml備用。

1.2 儀器與試劑 恒溫培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，離心機，恒溫干燥箱，Leica光學(xué)顯微鏡；RPMI1640培養(yǎng)基和秋水仙素（40？滋g/ml）（均購自廣州拜迪生物技術(shù)有限責(zé)任公司），胰酶（日本Sigma），0.075mol/L氯化鉀低滲溶液，新鮮配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），磷酸鹽緩沖液（pH7.4），吉姆薩染液（購自湖南湘雅基因技術(shù)有限公司）。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)時間 吸取250？滋l靜脈全血加入5ml培養(yǎng)基中，分別于當(dāng)天10點和18點各接種2瓶（至加秋水仙素時的培養(yǎng)時間分別為70h和62h）。

1.3.2秋水仙素處理 將2個時間點接種的細(xì)胞分為兩組，一組以終濃度為0.2？g/ml的秋水仙素作用1h，另一組處理3h（終濃度為0.08？g/ml）。

1.3.3滴片高度 滴片時將處理好的淋巴細(xì)胞懸液分別以2cm、10cm和30cm高度各滴冰玻片2張（每張1滴）。

1.4染色體制備 其余步驟參照《現(xiàn)代臨床分子與細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)》[1]進行。以細(xì)胞計數(shù)板對細(xì)胞懸液進行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為105～106/L后滴冰玻片。

1.5細(xì)胞分裂指數(shù)計算：以低倍鏡（10×）分別觀察每張玻片上細(xì)胞滴的左上、左下、右上、右下和中間5個視野，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)和分裂期細(xì)胞總數(shù)，按以下公式計算細(xì)胞分裂指數(shù)。

細(xì)胞分裂指數(shù)=分裂期細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

1.6計量資料以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示，運用統(tǒng)計軟件SPSS16.0的t檢驗對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)時間 同一標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)62h和72h后再用秋水仙素進行處理，均可獲得足夠的分裂相，統(tǒng)計結(jié)果顯示培養(yǎng)時間比較差異無顯著性（P>0.05）。見表1。

注：*P>0.05

2.2秋水仙素處理結(jié)果 經(jīng)不同濃度和不同時間的秋水仙素作用后，均獲得較多分裂相，其中終濃度為0.08？滋g/ml處理3h組的分裂相比終濃度為0.2？g/ml處理1h組明顯增多，差異有顯著性（P<0.05）。見表2。

注：*P<0.05

2.3滴片高度 油鏡觀察不同高度滴片后染色體的分散程度，2cm、10cm和30cm滴片上的染色體均分散良好。見圖1。

2cm高度 10cm高度 30cm高度

圖1 不同滴片高度對染色體分散的影響

3討論

隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，人們的優(yōu)生優(yōu)育意識增強，尤其我國計劃生育政策的實施使得人民在少生的同時更渴望得到健康生殖[2]，家族中的遺傳病史是否對其后代有影響？不良生育史夫婦是否能生育一個健康的寶寶？反復(fù)自然流產(chǎn)是否由染色體異常引起的呢？諸多的問題困擾著患者，同時也等待我們?nèi)ヌ接懡鉀Q。外周血淋巴細(xì)胞染色體分析雖然不能將所有的遺傳問題解決，但卻不失為解疑答惑的有力工具。

外周血淋巴細(xì)胞染色體制備包括細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞同步化、細(xì)胞低滲、細(xì)胞固定、細(xì)胞老化和顯帶等步驟，本次針對細(xì)胞培養(yǎng)時間、秋水仙素處理條件和滴片高度等幾個環(huán)節(jié)進行探討。參照其它實驗室或教科書的經(jīng)驗，外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的時間一般為68～70h，故本實驗室將待測染色體分析的外周血采集嚴(yán)格限定在上午10點～12點，假如當(dāng)天下午的申請單只能延續(xù)到下一個采集日進行，不僅影響臨床工作的開展，而且無形中浪費了患者的時間和金錢。故本實驗選取上午10點與本院下午下班的時間點（18：00）進行接種，發(fā)現(xiàn)兩時間點培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)之間無差異（P>0.05）。張清健等[3]研究顯示培養(yǎng)72h是人淋巴細(xì)胞分裂最旺盛的時期，此時進行同步化可獲得最多的分裂相，時間過短或過長均降低細(xì)胞分裂指數(shù)，可能得不到滿意的分裂相進行后續(xù)分析。本實驗顯示兩時間點均可獲得足夠的分裂相進行核型分析，在此時間范圍的申請單皆可受理，不會因為培養(yǎng)時間的縮短而影響結(jié)果的分析。提示外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)時間可能勿需那么嚴(yán)格。

秋水仙素是一種生物堿[4]，可抑制或破壞紡錘體微管的形成，從而將細(xì)胞同步化于分裂期，秋水仙素的劑量和作用時間的長短對分裂期細(xì)胞的數(shù)量和染色體的長度有影響，假如加入的量過多或處理時間長，雖然獲得的分裂相多但染色體濃縮、長度短、帶紋少，不利于核型分析；反之假如加入的秋水仙素量少或作用時間短，獲得的分裂相少或沒有分裂相，染色體雖然帶紋多但太細(xì)太長，也不利于分析[5]。劉愛生等[6]研究顯示在阻斷培養(yǎng)的4h內(nèi)任意時間加入相應(yīng)劑量的秋水仙素，能獲得形態(tài)完好、大小適中、分散均勻、輪廓清楚的中期染色體標(biāo)本相。本實驗室使用終濃度為0.2%的秋水仙素處理1h后可獲得較多的分裂相，但長度適中的染色體（比如550條帶左右）不多，本次改為低濃度的秋水仙素（終濃度為0.08？滋g/ml）作用3h后，細(xì)胞分裂指數(shù)明顯增加（P<0.05），而且?guī)Ъy清晰、帶紋增多的染色體較多。淋巴細(xì)胞的有絲分裂中期總程約20分鐘，秋水仙素可延長細(xì)胞分裂期，中期染色體的形態(tài)也在秋水仙素的作用下發(fā)生變化，本研究顯示為獲得足夠的、滿意的染色體分裂相應(yīng)盡量采用低濃度秋水仙素，并適當(dāng)延長作用時間。

總之，通過本次實驗將本實驗室外周血淋巴細(xì)胞染色體制備的細(xì)胞培養(yǎng)時間確定為62～70h，秋水仙素作用條件為終濃度0.08？滋g/ml處理3h，可在2cm左右高度滴片。在后續(xù)工作中應(yīng)用此條件也獲得了滿意的染色體玻片，使得染色體分析工作簡單易行。該條件可作為其他實驗室的參考，但每個實驗室最好在工作中不斷總結(jié)經(jīng)驗、建立適合自身的外周血淋巴細(xì)胞染色體制備條件。

參考文獻：

[1]丁顯平.現(xiàn)代臨床分子與細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)[M].第1版.成都：四川大學(xué)出版社，2002.

[2]左伋.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)[M].第5版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2004.

[3]張清健，鄭立新，田佩玲等.人外周血淋巴細(xì)胞高分辨染色體制備技術(shù)的研究[J].癌變.畸變.突變，2013，25（1）：63-64.

[4]張麗華，鄒向陽.細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)[M].第4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

[5]熊曉蕓.秋水仙素濃度對人體外周血淋巴細(xì)胞染色體制備的影響[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，20（2）：54-56.

[6]劉愛生，朱春燕.秋水仙素在人類染色體G顯帶制作中的應(yīng)用與討論[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2012，30（23）：107-108.編輯/許言