年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中骨連蛋白分析

摘要：目的 探討LECs中SPARC于年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體中的臨床表現(xiàn)，對(duì)比不同年齡白內(nèi)障晶狀體中SPARC的表達(dá)。方法 將108例白內(nèi)障患者按照年齡分組，利用常規(guī)蛋白印跡法檢測(cè)各組白內(nèi)障LECs中SPARC含量，并對(duì)比研究。結(jié)果 白內(nèi)障患者年齡大的一組，其LECs中的SPARC表達(dá)增加，并且SPARC的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)，表達(dá)愈來愈強(qiáng)烈。結(jié)論 SPARC在人體白內(nèi)障的發(fā)病過程中可能起到一定的作用，并且白內(nèi)障患者的晶狀體LECs中SPARC與患者的年齡相關(guān)。

關(guān)鍵詞：年齡相關(guān)性；對(duì)比研究； SPARC LECs

晶狀體上皮細(xì)胞（LECs' short of Lens Epithelial Cells）對(duì)白內(nèi)障發(fā)病密切相關(guān)，在白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理中具有重要意義，這與其結(jié)構(gòu)與功能的變化決定晶狀體（Crystalline lens）透明狀況。骨連蛋白（SPARC）是由多細(xì)胞分泌形成的小分子蛋白[1]，于人體中表達(dá)活躍，并有研究結(jié)果表明白內(nèi)障發(fā)病與SPARC含量增加有關(guān)。本文分組對(duì)108例白內(nèi)障患者的LECs中SPARC含量進(jìn)行對(duì)比研究，并將其分成正常對(duì)照組、氧化損傷組和熱應(yīng)激處理組，分析SPARC在不同年齡白內(nèi)障中的致病機(jī)理，以及探討其在白內(nèi)障的發(fā)病過程中起到的作用，并且分析其中的致病機(jī)理。

1 資料與方法

1.1一般資料 以本院108例白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)患者的晶狀體前囊膜作為實(shí)驗(yàn)研究材料，108例患者中有男性56例，女性52例，年齡36～82歲；所用實(shí)驗(yàn)試劑為羊抗人SPARC單克隆抗體（美國Santa cluz 公司）、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清（美國Gibco公司）；所用儀器為ThermoMLLtiskanMK3酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)、JIM-X電泳儀、凝膠自動(dòng)成像分析儀、GIS-700D型凝膠圖像系統(tǒng)。永生化人LECs系SRA01/04由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。

1.2方法

1.2.1樣本采集 對(duì)照組材料來自12例正常人角膜晶狀體前囊膜，在晶狀體的赤道部，剪開前囊然后取出囊膜。實(shí)驗(yàn)組為白內(nèi)障手術(shù)患者108例，根據(jù)年齡段分成4組（<48歲、48～64歲、65～78歲、>78歲年齡段組各27例），超聲乳化手術(shù)后取5mm直徑晶狀體前囊膜放入低溫冰箱中保存。在實(shí)驗(yàn)前把每組的囊膜集合放一起，合并后每組一共5例，臨床上分為皮質(zhì)型。

1.2.2細(xì)胞樣本 采用人LECsSRA01/04傳代培養(yǎng)樣本并將其分成正常對(duì)照組、氧化損傷組和熱應(yīng)激處理組。細(xì)胞中加入200*106mol/LH2O2作用6 h；熱應(yīng)激處理組： 42e30min， 37e恢復(fù)2 h。

1.2.3檢測(cè)SPARC含量 利用常規(guī)蛋白印跡法檢測(cè)各組白內(nèi)障LECs中SPARC含量：把細(xì)胞樣本囊膜剪碎并放入200μL裂解液中進(jìn)行超聲粉碎，接著進(jìn)行4℃、12000r/m in離心30min。BCA法定蛋白，對(duì)制成蛋白進(jìn)行凝膠電泳[2]。電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)過50min后，把膜放入3%BSA封閉12h。把BSA液體倒掉后加入1：500一抗進(jìn)行孵育，1h之后用TBS洗膜，重復(fù)三次，然后加入BCIP/NBT顯色劑顯色。接著用GIS-700D型凝膠圖像系統(tǒng)掃描分析，記錄分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[3]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)都服從正態(tài)分布，并且方差齊性檢測(cè)出方差齊。本次研究中，采用單因素方差分析進(jìn)行不同年齡組的LECs中SPARC的平均灰度值的比較，采用SNK-q檢驗(yàn)來對(duì)各組間平均灰度值的兩兩比較，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。

2結(jié)果

2.1 組織樣本 對(duì)照組43000處都沒見明顯的條帶，而實(shí)驗(yàn)組都有明確的SPARC表達(dá)（P < 0.05），由結(jié)果可知，SPARC的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)，表達(dá)愈來愈強(qiáng)烈。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，>78歲年齡段組比其他三組的表達(dá)都更強(qiáng)烈（P< 0.01），65～78歲組比64歲一下兩組表達(dá)均增高（P < 0.01），48～64歲組比<48歲組增高，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.055）

2.2細(xì)胞樣本 對(duì)照組43000處都沒見明顯的條帶，氧化損傷組和熱應(yīng)激處理組都能見到明顯的SPARC表達(dá)。在細(xì)胞樣本正常對(duì)照組未見明確的SPARC表達(dá)，但是在白內(nèi)障組中可見明顯的表達(dá)。

3 討論

體內(nèi)很多細(xì)胞均可分泌SPARC這種蛋白，所以LECs也有比較豐富的表達(dá)。SPARC的生物學(xué)功能很多，主要是抗增生、調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的作用、與細(xì)胞因子結(jié)合以及相互作用、對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響以及對(duì)損傷愈合血管的發(fā)生有影響等。

早期研究中發(fā)現(xiàn)，SPARC是一種細(xì)胞周期抑制劑，能夠抑制細(xì)胞周期性分化，它的去粘附作用主要是由于局部粘連的溶解和肌動(dòng)蛋白纖維的重組造成的[4]?；赟PARC的調(diào)節(jié)作用體現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外環(huán)境的變化作用相應(yīng)的表達(dá)，這種作用能夠影響生長(zhǎng)因子，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。SPARC與PDGF、VEGF的結(jié)合，并且通過終止生長(zhǎng)因子的相互作用，從而減低了分化生長(zhǎng)的能力。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)，SPARC的作用不僅僅上述這些，還有能夠促進(jìn)膠原纖維形成的功能，也就是說SPARC有膠原分子伴侶的作用。

科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)[5]，在小白鼠的胚胎肝細(xì)胞中的SPARC的位點(diǎn)消除，沒有SPARC的小白鼠能夠正常的生長(zhǎng)發(fā)育并且繁殖后代，但出生6個(gè)月后出現(xiàn)眼部疾病，主要表現(xiàn)在晶狀體囊膜破裂以及白內(nèi)障的形成。提示SPARC參與了白內(nèi)障的發(fā)生，本次試驗(yàn)也證實(shí)了LECs中SPARC的表達(dá)較正常晶狀體表達(dá)有明確上調(diào)。在白內(nèi)障的形成過程中，氧化損傷和熱應(yīng)激是兩個(gè)非常重要的影響因素，因?yàn)楫?dāng)晶狀體對(duì)外界產(chǎn)生了應(yīng)激時(shí)，SPARC的表達(dá)效果才高。在臨床上也可以發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增大，白內(nèi)障患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率較小，并且復(fù)發(fā)后的發(fā)病程度也有所減輕，所以這也可以考慮SPARC隨年齡增長(zhǎng)高表達(dá)有一定的關(guān)系。但是這種蛋白通過那種通道和途徑來對(duì)人體產(chǎn)生作用，是否涉及到已知的信號(hào)傳導(dǎo)通路，還是其它未知的信號(hào)傳導(dǎo)通路，這在將來還需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本次試驗(yàn)證實(shí)65歲以上患者LECs中SPARC表達(dá)明顯增高，并且患者年齡越高，表達(dá)也充分。鑒于LECs對(duì)老年人白內(nèi)障有密切關(guān)系，可以考慮預(yù)防和治療白內(nèi)障的用藥是針對(duì)抑制LECs增生、粘附的作用為主。

參考文獻(xiàn)：

[1] 林雯，謝茂松，徐國興，何青，鄭衛(wèi)東. 水通道蛋白-1在高糖培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)[J].眼科研究，2010.

[2] 陶丹，王雪梅，雷霍. 年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中hTERT的活性表達(dá)[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010 .

[3] 鄭廣瑛，梁圓圓，王倩. 年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞的Smac、caspase-3表達(dá)及死亡方式[J]. 眼科研究，2010 .編輯/許言