腦外傷合并骨折處骨痂中低氧誘導因子的表達

摘要：目的 探討腦外傷合并骨折組與單純骨折組骨折處骨痂組織中低氧誘導因子（HIF-1）的表達。方法 對98只SPF級健康SD大鼠進行造模，其中A組（腦外傷合并骨折組）50例，B組（單純骨折組）48例，造模成功后分別在1～4w每周周末剖取骨痂組織進行HE染色和免疫組化染色。利用高倍顯微鏡觀察組織中4個互不重疊視野，計算細胞HIF-1陽性率，灰度值、光密度值、積分光密度值，觀測細胞HIF-1的表達。結果 A組的各種指標均在第1w末達到高峰后開始換面下降，說明HIF-1在腦外傷合并骨折后增多，其后雖下降但任然活躍，加速骨折愈合。而單純骨折組所有指標均無明顯變化。結論 腦外傷合并骨折組的骨痂組織中HIF-1的表達較單純骨折組有明顯增多。HIF-1對骨折愈合有促進作用。這為日后臨床治療骨折愈合，提高治療效率提供新方向和新靶點。

關鍵詞：腦外傷；骨折；骨痂；低氧誘導因子；HIF-1

在20世紀60年代，Gibson和Robe's最早報道了腦外傷合并骨折的情況。發(fā)現(xiàn)骨折處有成形的骨痂，甚至還出現(xiàn)了異位骨化。腦外傷合并骨折后，骨折愈合加速的現(xiàn)象引起了世界范圍的關注。目前認為這種現(xiàn)象與體內(nèi)信號分子及內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)有關。目前認為這是由于骨損傷后，參與骨修復的細胞處在一種低氧或者缺氧的狀態(tài)。由于這種低氧的狀態(tài)誘導一系列轉錄因子的表達，這些因子參與了一系列修復過程包括血管形成，糖代謝以及細胞的生長和生殖。而近年來一些研究表明，受損的腦垂體和腦組織內(nèi)存在大量的炎性細胞，這些炎性細胞可以釋放出不同的細胞因子[1]。其中一種新發(fā)現(xiàn)的轉錄因子即是低氧誘導因子HIF-1，它能夠調(diào)節(jié)蛋白質合成，誘導血管生成，還能夠對骨形成起到一定促進作用[2]。因此本實驗主要采用腦外傷合并骨折模型和單純骨折模型，比較兩者骨痂處HIF-1的表達，探討HIF-1與骨折愈合加速的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 本科室于2013年6月購入98只SPF級健康SD大鼠（由廣東省實驗動物中心提供）。隨機分為A組（腦外傷合并脛骨骨折組）50只，B組（單純脛骨骨折組）48只，兩組均不限性別。所有大鼠體重為（180±20）g。所有大鼠均單獨飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1建立腦外傷模型 根據(jù)Feeney法建立大鼠腦外傷模型[3]。用10%水合氯醛按照0.3ml/100g的劑量對大鼠進行腹腔注射。待大鼠完全昏迷后，使其仰臥位固定在腦立體定向儀上。利用處理過的無菌手術刀沿頭正中線切開頭皮暴露右側顱骨。利用電動牙科鉆在冠狀縫后1.5mm、正中線右側開直徑約5mm的骨窗。在操作過程中注意保持硬膜完整。開骨窗后立刻使用導管對準骨窗，并在骨窗上30cm處設置20kg砝碼，沿著導管墜落，撞擊硬膜，造成中度腦損傷。撞擊后在切口內(nèi)用處理過的潔凈橡膠滴管滴硫酸慶大霉素5～6滴。用骨蠟封閉骨窗后縫合切口。

1.2.2 建立脛骨骨折模型 利用上述麻醉方法麻醉大鼠后，使其仰臥并將其四肢固定在操作臺上。消毒皮膚后在脛骨前外側沿脛骨切開約1cm唱切口一個，暴露右脛骨。利用線鋸在脛骨結節(jié)下1cm處橫向鋸斷脛骨。切斷后用直徑2mm左右的克氏針進行髓腔內(nèi)固定。切口內(nèi)滴加硫酸慶大霉素預防感染，并縫合傷口。A組動物建立腦外傷模型同時建立脛骨骨折模型；B組動物只建立脛骨骨折模型。模型建立后分組飼養(yǎng)，觀察實驗動物總體狀況，檢測生命體征，并及時對生命體征，體態(tài)出現(xiàn)異常的動物進行對癥處理，維持動物生命。

1.2.3 HE染色和免疫組化染色 在建立模型成功后4w，每周末分別在各組隨機選取5只動物，并用10%的水合氯醛進行腹腔注射麻醉。麻醉后將其仰臥固定在操作臺上，小心剖開腹腔，胸腔。利用灌注穿刺針刺入左心室，固定；同時剪開右心耳。先用生理鹽水約150ml快速從左心室進行關注，沖洗干凈血液后，用4%聚甲醛生理鹽水混合液約400ml以同樣方式灌注，注意灌注速度先快后慢，固定30min以上。灌注完成后大鼠全身僵硬即為灌注成功。大鼠固定后，切開脛骨骨折造模部位，截取距離骨折處上下約0.5cm處的骨痂組織，取出后將其放置在4%多聚甲醛中，并4℃環(huán)境中固定24h后取出，有哪個蒸餾水浸泡4h。其后用乙二胺四乙銨進行脫鈣處理，以針頭可輕易插入骨皮質為處理完成標準。然后修整組織標本，常規(guī)進行梯度酒精脫水，然后使用石蠟實施縱向包埋后放入4℃冰箱。石蠟凝固后取出，沿著脛骨縱軸用切片機進行連續(xù)縱行切片，厚度約4μm。

1.3觀察方法 隨機選取切片，進行HE染色：烤片溫度設置為70℃，時間30min；然后用蘇木精染色4min，伊紅染色3min。將完成染色的片放置在光學顯微鏡下分別對組織中的成纖維細胞、成骨細胞以及軟骨細胞進行觀察。

在顯微鏡下分別觀察骨痂組織內(nèi)各種細胞分成內(nèi)低氧誘導因子的相關表達情況。以細胞漿內(nèi)含有棕黃色顆粒為陽性判斷標準；使用0.1mol/L PBS緩沖液為陰性對照，若一抗無棕黃色，則判斷為具有明顯的特異性。所有標本均用高倍顯微鏡下觀察無重疊的4個視野。然后對圖像進行重建組合，并平均每個視野的光密度值、灰度值、積分光密度值以及陽性細胞率（HIF-1陽性細胞率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%）進行計算和統(tǒng)計。

1.4統(tǒng)計學方法 利用SPSS19統(tǒng)計學軟件包對所有相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，行t檢驗，計數(shù)數(shù)據(jù)用χ2檢驗，P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 A組骨痂在第1w末顯示。細胞核部分呈扁圓形。核染色較深，胞質內(nèi)含有線粒體或溶酶體，胞體呈水腫樣，而且細胞與細胞之間存在縫隙連接，上述表現(xiàn)表明骨細胞出現(xiàn)了明顯的生長；另外有部分細胞核仁呈圓形且較大。核染色較淡，說明存在成纖維細胞。B組顯示出存在成纖維細胞，但是骨細胞存在不明顯。骨折2w后骨細胞及冉谷細胞數(shù)目（如表1），A組數(shù)據(jù)雖然都顯示骨細胞和軟骨細胞的數(shù)量逐步增多，但是增加速度相對而言已經(jīng)開始變緩。B組實骨細胞、軟骨細胞數(shù)量較少，同樣也處在不斷增加的修復過程中。顯示A組骨痂組織修復速度較B組快，其恢復速度更佳，差異性十分明顯（P<0.05）。

2.2免疫組化檢測結果 免疫組化染色后再高倍數(shù)顯微鏡下觀測骨痂組織HIF-1陽性率（見表2）。HIF-1在造模成功后第1w末，兩組的陽性率比較具有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.05）。A組HIF-1陽性率較B組HIF-1陽性率高，說明HIF-1在A組中表達較B組多，骨折愈合速度也較B組快。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，HIF-1陽性率在第1w末達到高峰之后，便開始下降，直到第4w末，與B組HIF-1陽性率比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。通過對灰度值，光密度值和積分光密度值的比較（見表3～5），可見，這幾項指標受HIF-1陽性細胞率的影響，均在第1w末達到高峰后緩慢下降。而B組則變化不明顯。到達第4w后，兩組指標均無明顯差異（P>0.05）。這表示A組內(nèi)的HIF-1表達較B組多。而實體觀察大鼠整體狀況可得知，A組骨折處愈合速度也較B組快。雖然A組愈合速度隨著時間推進而慢慢減緩，但一直處于持續(xù)愈合狀態(tài)，B組則無明顯變化。由此可見，腦外傷合并骨折的大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的HIF-1對大鼠的骨折愈合作用具有一定的影響，與B組相比具有明顯差異（P<0.05）。

4 討論

當前臨床上對腦外傷合并骨折的愈合速度較一般單純性骨折的原因機制尚不明確，因此闡明此現(xiàn)象的機制具有十分重要的醫(yī)學研究意義。隨著骨修復進展，血管的重建和充足的血供是骨修復過程中最重要的環(huán)節(jié)。HIF-1是目前發(fā)現(xiàn)細胞為適應低氧或缺氧而產(chǎn)生的調(diào)控因子，其對血管的生成和細胞的生長起了十分重要的作用。因此從另外一個側面活命，HIF-1對骨修復，骨折的愈合也起到一定的作用[4-6]。

在本試驗中，實驗結果顯示兩組模型的骨折愈合速度以及骨痂處HIF-1的表達都具有明顯的差異性。A組的骨痂處在第一周末HIF-1陽性細胞率在第一周周末達到最高，骨細胞生長明顯增多，成纖維細胞活躍；其余指標如平均灰度值，平均光密度值，平均積分光密度值也達到最大值，表明骨痂組織持續(xù)礦化；而在其后2～4w后，HIF-1陽性率減少，骨細胞增長速度減緩，但總體數(shù)量依舊在增加，軟骨細胞數(shù)量總體增多，成纖維細胞活躍性減少，但相對還是比較活躍。B組所有指標在模型建立后，1～4w后無明顯變化。

HIF-1有兩部分組成，包括對氧敏感的α亞基和穩(wěn)定的β亞基，兩者組成的二聚體。其中HIF-1的活性主要由HIF-1α決定。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導因子-1具有調(diào)控低氧下骨髓間充質干細胞增殖，維持肝細胞特性的調(diào)控因子，因此可以促進骨折愈合，治療骨折并發(fā)癥[7-10]。

本實驗的結果表明，在大鼠腦外傷合并骨折后， IF-1促進骨折愈合的速度和作用較單純骨折的大鼠作用更加明顯。符合臨床上HIF-1有利于促進骨折愈合的結果。在骨痂組織中HIF-1的表達，腦外傷合并骨折較明顯骨折組增多，說明在骨痂組織中，HIF-1的表達增多，有利于骨痂組織的持續(xù)礦化和骨折愈合。為臨床上治療骨折愈合，提高治療骨折速度，提供了新靶點和新方向，具有重要的臨床意義。

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