新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的原代分離、培養(yǎng)與鑒定

摘要：目的 探究新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar typeⅡepithelial cell， AT-Ⅱ）的原代分離、培養(yǎng)及鑒定方法，建立體外細胞模型。方法 取SPF級新生Wistar大鼠肺臟，采用胰蛋白酶聯(lián)合膠原酶消化法分離AT-Ⅱ，免疫黏附法純化細胞，體外培養(yǎng)并進行傳代研究，透射電鏡鑒定細胞。結(jié)果 AT-Ⅱ細胞原代培養(yǎng)和傳代研究成功，細胞生長狀態(tài)良好。電鏡觀察到板層小體。結(jié)論 采用改良方法獲得的AT-Ⅱ細胞符合體外實驗要求，第24～72h內(nèi)處于最佳生長狀態(tài)，是進行實驗研究的良好時間段。

關(guān)鍵詞：新生大鼠；肺泡Ⅱ型上皮細胞；原代培養(yǎng)；鑒定

肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar typeⅡepithelial cells，AT-Ⅱ）是肺泡上皮細胞的干細胞，又被稱為\"顆粒性肺泡細胞\"和\"分泌細胞\"，是一種多功能細胞。AT-Ⅱ除了能增殖成新的AT-Ⅱ細胞，還可分化為肺泡Ⅰ型上皮細胞（alveolar typeⅠepithelial cell，AT-Ⅰ）[1]。AT-Ⅰ和AT-Ⅱ共同組成肺泡上皮屏障。AT-Ⅱ約占肺泡細胞群的60%[2]，細胞形態(tài)為多角形、立方形或圓形，細胞質(zhì)內(nèi)有大量反差明顯的細小顆粒。應(yīng)用AT-Ⅱ開展相應(yīng)研究，對認識肺的正常生理功能和多種肺部疾病有重要意義。

原代培養(yǎng)、分離、純化可以排除其他肺組織細胞對AT-Ⅱ的影響[3]。有文獻報道AT-Ⅱ易變性、易分化，表型喪失快，基本不能傳代[2]。亦有文獻報道它具有無限增殖的潛能[4]。本次實驗在借鑒他人實驗方法的基礎(chǔ)上進行了簡化改良，順利進行了AT-Ⅱ的原代培養(yǎng)、分離、純化與鑒定，并進行傳代研究。

1 資料與方法

1.1實驗動物 SPF級新生24h內(nèi)Wistar大鼠，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研試驗中心SPF級實驗室提供。

1.2實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胎牛血清、0.2%膠原酶、0.5%胰蛋白酶、10%水合氯醛、75%乙醇、IgG溶液、100U青霉素、100U鏈霉素、5%戊二醛。

1.3方法

1.3.1新生大鼠AT-Ⅱ細胞的原代分離 取SPF級新生24h內(nèi)Wistar大鼠，借鑒張秋月[5]等的方法加以改良進行實驗操作。10%水合氯醛麻醉乳鼠（0.3ml/100g），放入75%乙醇消毒1min。在超凈臺內(nèi)進行無菌操作，取出肺組織，將其置于盛有5ml預(yù)冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中，去除氣管、支氣管和小血管等組織，吸棄液體和雜質(zhì)，再用無菌PBS反復(fù)沖洗直至液體澄清，吸棄液體后用無菌手術(shù)剪將其剪成lmm3碎塊。將其轉(zhuǎn)移至10ml無菌離心管中，加入0.2%膠原酶6ml，置于37℃恒溫震蕩水浴箱內(nèi)消化1h，再加入4ml0.5%胰蛋白酶消化30min，4℃條件1500r/min離心5min，棄上清。加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5ml終止消化，吹打均勻，200目金屬濾網(wǎng)過濾細胞懸液，將細胞濃度調(diào)至（2～3）×106個/ml。

1.3.2 AT-Ⅱ細胞的純化 借鑒Dobbs[6]等采用的IgG吸附純化法對AT-Ⅱ細胞進行純化。將調(diào)整好濃度的AT-Ⅱ細胞懸液，轉(zhuǎn)移至事先制備好的用大鼠IgG包被的無菌培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育90～120min，移出未黏附的細胞，4℃條件800r/min離心l0min，棄上清[6-7]。

1.3.3細胞培養(yǎng) 取細胞沉淀，用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素）重懸細胞于一次性無菌培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細胞濃度為（2～3）×106個/ml，置于37℃，5%CO2孵箱內(nèi)。培養(yǎng)24h后，移除未貼壁細胞，無菌PBS洗2次，用完全培養(yǎng)基進行細胞換液。在倒置相差顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)時間后細胞的貼壁生長情況和形態(tài)特征變化。

1.3.4細胞鑒定 AT-Ⅱ的鑒定方法有多種，如透射電鏡、免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色、堿性磷酸酶（AKP）染色鑒定等。電鏡下可清楚觀察到AT-Ⅱ胞質(zhì)內(nèi)的特征性板層小體（嗜鋨小體），是鑒定AT-Ⅱ的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，故采用該法進行細胞鑒定。用0.25%胰酶消化細胞，胎牛血清終止消化，稍作吹打后1000r離心7min，棄上清，加0.5ml 5%戊二醛固定。制備為電鏡細胞標(biāo)本，于透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1細胞生長狀態(tài) 實驗結(jié)果表明：新生大鼠AT-Ⅱ細胞原代培養(yǎng)24～36h大量貼壁，呈島狀生長；36～48h，細胞平展呈多邊形或圓形，相互連接成細胞單層，胞質(zhì)內(nèi)有大量反差明顯的細小顆粒，細胞核明顯；48～72h，細胞大量增殖，是生長最旺盛、活力最強的時期；第4～5d，細胞形態(tài)逐漸拉長，變扁平，胞內(nèi)顆粒逐漸減少；第6～7d，細胞特征難以清晰辨認。其生長過程經(jīng)歷了增殖、停滯、凋亡 3 個時期，生化特性變化快，在24～72h內(nèi)處于最佳生長狀態(tài)[8]。增殖期是進行體外實驗的良好時間段，故其研究應(yīng)在初始培養(yǎng) 3d內(nèi)進行[9]。

2.2 AT-Ⅱ細胞傳代情況 實驗結(jié)果顯示，該細胞原代培養(yǎng)4d左右適合傳代，且傳代細胞生長正常，已傳至第5代細胞未死亡。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)傳代細胞存在特征性結(jié)構(gòu)板層小體，但原本反差明顯的顆粒變小變淺，說明細胞的某些性質(zhì)還是在改變。此外，還探究用傳代培養(yǎng)的AT-Ⅱ代替原代細胞進行實驗的可能性。

2.3鑒定結(jié)果 透射電鏡下觀察到AT-Ⅱ細胞質(zhì)內(nèi)有大量反差明顯的深色顆粒，為其特征性結(jié)構(gòu)板層小體，呈同心圓結(jié)構(gòu)。

3 討論

AT-Ⅱ是一種多功能干細胞，對維持肺泡結(jié)構(gòu)和功能有重要意義，其損傷缺乏、異常增生分化與慢性阻塞性肺部疾病、肺纖維化和肺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系[8]。其增殖、分化機制與肺發(fā)育不良相關(guān)疾病、新生兒呼吸窘迫綜合征等過程都有著密切聯(lián)系[9]。它可維持肺泡內(nèi)外液體平衡，其缺乏與急性肺損傷后肺水腫關(guān)系密切[8]。還具有免疫調(diào)節(jié)作用。目前，對于AT-Ⅱ的研究是在肺纖維化及肺癌發(fā)病中較為活躍的課題[10]。

提取成年大鼠AT-Ⅱ的操作復(fù)雜，灌肺洗肺后才能進行消化分離[11]。提取胎鼠AT-Ⅱ需要剖宮取鼠，增加取材難度和時間，且會導(dǎo)致大鼠死亡而增加成本。新生大鼠成本最低，取材純度相對較高，故選用。

AT-Ⅱ的分離可采用多種酶消化法。其中彈性蛋白酶效果最佳，但因其昂貴不易推廣。胰酶經(jīng)濟適用，常作為消化首選[10]。胰酶和膠原酶的聯(lián)合消化法也是文獻報道的常用方法，合適的酶濃度和消化時間至關(guān)重要[12]。本實驗采用聯(lián)合消化法，效果較好。AT-Ⅱ的純化方法很多，差速離心和免疫黏附法是高效分離和純化AT-Ⅱ的方法， 所得細胞產(chǎn)量大、純度高[13]。電鏡鑒定AT-Ⅱ是目前最好的方法。電鏡下可清楚觀察到胞質(zhì)內(nèi)的特征性板層小體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器，還可觀察體外培養(yǎng)細胞的分化程度[11]。

本實驗對AT-Ⅱ生長狀況的研究結(jié)果與文獻報道基本相符，細胞在培養(yǎng)第 24～72 h內(nèi)處于最佳生長狀態(tài)[8]，是進行體外實驗的良好時間段。在培養(yǎng)第4～5d傳代效果佳。傳到第5代其生物學(xué)特性逐漸消失，有助于研究其凋亡機制。

綜上所述，本實驗采用新生大鼠取材并通過改良的酶聯(lián)合消化法分離、純化、培養(yǎng)AT-Ⅱ的方法可行，為AT-Ⅱ的體外研究提供了相關(guān)技術(shù)儲備。該體外細胞模型為研究多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展奠定了實驗基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]符躍強，蔣靜.大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的培養(yǎng)、鑒定及體外特性初步研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2010， 39（15）：1988-1990.

[2]張雪梅，陳海龍，等.大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離、純化和鑒定[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2011，17（5）：489-491.

[3]劉秀香，張海鴻.肺泡Ⅱ型上皮細胞的生長狀況及其轉(zhuǎn)分化的鑒定[J].實用兒科臨床雜志，2011，26（16）：1287-1292.

[4]周曉光，劉秀香，劉任紅，等.高氧暴露早產(chǎn)大鼠肺泡上皮細胞損傷與細胞外基質(zhì)變化的動態(tài)研究[J].中國新生兒科雜志，2008，23：215-218.

[5]張秋月，富建華，薛辛東.新生鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞分離培養(yǎng)與鑒定[J].中國新生兒科雜志，2010，25（6）：339-341.

[6]Dobbs LG， Williams MC， Brandt AE. Changes in biochemical char acteristics and pattern of lectin binding of alveolar typeⅡcellswith time in culture [J]Biochem Biophys Acta，1985，846（1）：155.

[7]Chen J， Chen Z， Narasaraju T， et al. Isolation of highly pure alveolarepitheIial type I and typeⅡcells from rat lungs[J].Lab Invest，2004，84（6）：727.

[8]鄭金旭，黃振杰，等.構(gòu)建原代分離培養(yǎng)與鑒定小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的方法及模型[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（15）：2761-2764.

[9]張盼，張曉群，邱潔，等.胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞生長狀況及 ABCA3表達變化的初步研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，32 （11）：1488-1492.

[10]周莉，金克煒.肺泡Ⅱ型上皮細胞及其分離鑒定與原代培養(yǎng)[J].中國肺癌雜志，2003，6（3）：236-238.

[11]郝嘉，李永旺，肖穎彬.大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞體外培養(yǎng)和鑒定[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，22：500-501.

[12]曾慶富，蔣海鷹，等.肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離純化及原代培養(yǎng)[J].中華病理學(xué)雜志，1998，27（5）：384-385.

[13]陳慧，王振花，等.胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞分離、原代培養(yǎng)與鑒定[J].中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2006，27（5）：496-500.

編輯/哈濤