咳喘寧對(duì)哮喘大鼠TLR4表達(dá)的影響

摘要：目的 觀察咳喘寧對(duì)哮喘大鼠TLR4表達(dá)的影響，闡明其防治哮喘的作用機(jī)理。方法 用卵清蛋白復(fù)制大鼠哮喘模型，以布地奈德為陽性對(duì)照藥，觀察咳喘寧干預(yù)后肺泡灌洗液中、肺組織中TLR-4的改變情況。結(jié)果 TLR4在哮喘大鼠支氣管粘膜上皮細(xì)胞、肺泡中有顯著表達(dá)?？却瓕幠苡行Ы档拖笫笾蠺LR4的表達(dá)，從而減輕了氣道的高反應(yīng)性。布地奈德減少支氣管粘膜、肺泡胞漿中TLR4的表達(dá)優(yōu)于咳喘寧，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 咳喘寧能降低TLR4表達(dá)水平，提示咳喘寧治療哮喘可能與下調(diào)TLR4表達(dá)水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞：哮喘；咳喘寧；TLR-4；麻黃；杏仁

支氣管哮喘（bronchial asthnla。簡稱哮喘）是最常見的慢性肺部疾病。我國兒童哮喘總發(fā)病率為0.9%～1.1%，其中半數(shù)在3歲以前發(fā)病[1]，近年來發(fā)病率有明顯上升趨勢。該病是以特應(yīng)質(zhì)為基礎(chǔ)。在各種誘發(fā)因索作用下產(chǎn)生的慢性氣道變應(yīng)性炎癥。迄今為止，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。大量研究顯示，Toll樣受體（Tolllike receptors，TLRs）是天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁，在哮喘的發(fā)生發(fā)展中可能起著較重要的作用[2]?？却瓕帉?duì)小兒哮喘有較好的療效，為了探討其作用機(jī)理，觀察其對(duì)哮喘大鼠TLR4表達(dá)的影響?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)告如下：

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1動(dòng)物 幼年SD大鼠（清潔級(jí)，120～180g，雄性，28～42d）分成四組：正常組、模型組、咳喘寧治療組、布地奈德組。

1.1.2藥物 咳喘寧由炙麻黃、杏仁、桃仁、大青葉、黃芪、生石膏、細(xì)茶和甘草等中藥組成。湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院制劑室提供，批號(hào)：200501，每100mL含生藥24.6g。

1.1.3試劑及儀器 雞卵清蛋白，美國Sigma公司；氫氧化鋁（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；TLR4抗體，武漢博士德；自制霧化箱；醫(yī)用超生霧化器，上海四菱醫(yī)用恒溫設(shè)備有限公司；自動(dòng)純水雙蒸餾器，上海玻璃儀器一廠；普通離心機(jī)（低速），湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠；4℃冰箱；微波爐；37℃溫箱一臺(tái)；石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)；光學(xué)顯微鏡。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型制 50只大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)潔凈動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，每5只1籠，自由飲食，控制室溫21 ℃左右，濕度55%左右。所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)抽出16只作為A組即正常組，除A組外，其余34只大鼠分別于第1d和第8d分在胸部皮下三點(diǎn)及腹腔注射共1 mL含1 mg卵清蛋白（OVA）和100 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液致敏，正常組于第1d和第8d分胸部皮下三點(diǎn)及腹腔注射生理鹽水1ml；第9d～第21d為激發(fā)階段，通過超聲霧化器以5%卵清蛋白溶液霧化1次/d，30 min/次，連續(xù)2w。造模成功后34只大鼠隨機(jī)分為四組：模型組（10只），布地奈德組（12只），咳喘寧組（12只）。

1.2.2治療方案 造模后（激發(fā)階段）進(jìn)行治療。霧化2次/d，20min/次。按照《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[3]人與動(dòng)物等效劑量換算方法，各組藥物用量如下：咳喘寧組以咳喘寧口服液霧化，每只量為0.66ml/次，溶于20 mL蒸餾水中霧化；布地奈德組以布地奈德每只0.05 ml/次，溶于20ml蒸餾水中霧化；正常組及模型組以等量蒸餾水霧化吸人。各組霧化治療時(shí)間均為7 d。

1.2.3免疫組化染色 動(dòng)物處死后切取肺組織，冰凍后行超薄切片（5u m）后用冷丙酮固定。后行TLR-4免疫組織化學(xué)染色。以細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色的細(xì)胞為TLR-4陽性細(xì)胞。

1.2.4圖像分析、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各種免疫組化陽性反應(yīng)強(qiáng)度用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。陽性反應(yīng)強(qiáng)度應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)灰度值（灰度值與陽性強(qiáng)度呈現(xiàn)反比） 表示。應(yīng)用SPSS軟件包AVONA方差分析差異顯著性分析，所有數(shù)據(jù)用\"均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差\"表示。

2結(jié)果

2.1肺組織病理形態(tài)改變 正常組氣道粘膜完整無脫落，基膜無增厚，支氣管管壁及周圍炎性細(xì)胞浸潤少見，模型組呈顯著炎癥變化，氣道粘膜脫落，基膜增厚明顯，肺泡內(nèi)大量炎癥細(xì)胞，支氣管內(nèi)有粘液栓形成，周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤。布地奈德組氣道粘膜增厚不明顯，粘膜下水腫少見，在肺泡壁支氣管見少量炎性細(xì)胞浸潤，咳喘寧組輕度炎癥變化，較布地奈德組無明顯差異。哮喘模型建立成功，咳喘寧治療哮喘大鼠有效，且效果與布地奈德無明顯差異。

2.2肺組織TLR4表達(dá)變化 免疫組化染色結(jié)果顯示，TLR4陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色，主要位于支氣管粘膜及肺泡的細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核及細(xì)胞膜中亦可見。TLR4在正常組偶見陽性表達(dá)；哮喘模型組表達(dá)增加，可見大量陽性反應(yīng)細(xì)胞，主要分布在氣管黏膜及肺泡中；咳喘寧組、布地奈德組陽性細(xì)胞表達(dá)較哮喘模型組明顯減少，但仍較正常組顯著，呈陽性表達(dá)。其中布地奈德組稍優(yōu)于咳喘寧組。模型組TLR4陽性表達(dá)圖像分析的灰度值（113.08±14.12）低于其他三組，組間比較均有顯著差異（P<0.05），提示正常組支氣管粘膜上皮細(xì)胞胞漿及肺泡中陽性表達(dá)明顯高于其他三組。布地奈德組灰度值（149.24±3.22）與咳喘寧組灰度值（133.32±5.38）較模型組有顯著差異（P<0.05）。咳喘寧組的陽性表達(dá)與布地奈德組相較強(qiáng)，但無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

3討論

研究表明，Toll樣受體（toll likereceptor，TI R）介導(dǎo)天然免疫并連接獲得性免疫，在氣道炎癥的調(diào)節(jié)中起重要作用，特別是TI R4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參與了復(fù)雜的哮喘氣道高反應(yīng)形成過程。在哮喘氣道炎癥中，Th2細(xì)胞的優(yōu)勢應(yīng)答是哮喘慢性氣道炎癥形成的基礎(chǔ)。在過敏性氣道炎癥中，TLR4與適應(yīng)性免疫調(diào)控聯(lián)系緊密，其主要通過TLR4與適應(yīng)性免疫調(diào)控聯(lián)系緊密，其主要通過調(diào)節(jié)Thl/Th2型免疫應(yīng)答參與了氣道高反應(yīng)形成[4]。既往研究認(rèn)為，TLR4配體LPS水平?jīng)Q定氣道炎癥反應(yīng)的類型：低劑量LPS能引起伴有肺嗜酸粒細(xì)胞、高血清IgE、IL-4、IL-5和IL-13水平的變應(yīng)原特異性Th2應(yīng)答；高劑量LPS則引起伴有中性粒細(xì)胞和IgG抗體產(chǎn)生的Thl應(yīng)答。哮喘的嚴(yán)重程度與TLR4水平高低有關(guān)系，表明哮喘發(fā)作與TLR4有密切關(guān)系。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為.哮喘內(nèi)有痰飲留伏，外因邪氣引動(dòng)而誘發(fā)。感受六淫外邪以風(fēng)寒風(fēng)熱為多[5]。咳喘寧口服液以傳統(tǒng)古方五虎湯為基本方研制而成。方中麻黃乃\"喘家圣藥\"，味苦辛、性溫，能宣肺氣，平咳喘，其主要含麻黃堿，具有抗炎、平喘和抗過敏效應(yīng)；苦杏仁味苦、性微溫，能降肺氣平喘止咳。二藥有宣有降，可祛除外邪，暢通氣道，從而降低氣道反應(yīng)性，共為本方君藥。石膏味辛甘、性大寒，功在清泄肺熱；大青葉清熱抗炎，具有抗病毒作用；黃芪扶正祛邪，能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)病毒誘生干擾素的能力，抑制病毒，并具有類似激素樣作用。三藥合用，可清除哮喘的激發(fā)因素，共為本方臣藥。桃仁活血化瘀以改善微循環(huán)，改善炎癥病灶，尚可止咳平喘；細(xì)茶葉昧苦甘、性寒，功在清神化痰；甘草鎮(zhèn)咳平喘，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)作用，共為本方佐使。諸藥合用，共奏發(fā)表清熱、化痰平喘、清除哮喘激發(fā)因素、降低氣道反應(yīng)性等功效[6]。

既往研究表明：咳喘寧治療病毒誘發(fā)的哮喘具有較好的療效，能顯著提高哮喘患兒血中Ⅱ-12、降低IL-4，其作用明顯優(yōu)于對(duì)照組（P<0.01）[7]?？却瓕幠芙档头谓M織中EOS浸潤，從而降低了氣道反應(yīng)性和平滑肌收縮程度，緩解了支氣管痙攣[8]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)咳喘寧能降低哮喘大鼠中TLR4的表達(dá)，從而減輕了氣道的高反應(yīng)性。

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