細(xì)菌鞭毛銀染法技術(shù)

摘要：本文介紹了細(xì)菌鞭毛銀染法技術(shù)，對(duì)操作者鞭毛染色大有幫助，其染色效果十分理想，值得同行們借鑒學(xué)習(xí)。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌；鞭毛；銀染法；培養(yǎng)基；玻片；染色

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1供試菌種 枯草桿菌（Bacillus subtilis）.粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）由湖南師范大學(xué)微生物教室提供。

1.1.2培養(yǎng)基 配方組成：牛肉膏10 g，蛋白胨15 g，瓊脂15 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2。（牛肉膏、蛋白胨由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)，瓊脂由福建省石獅市寶雙塔瓊脂加工廠生產(chǎn)）。按上述配方配好培養(yǎng)基后，用干凈試管分裝包捆好，經(jīng)高壓滅菌擺斜面冷卻凝固， 然后放入冰箱冷藏24 h，使斜面析出冷凝水，為供試菌活化提供斜面培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1載玻片洗滌 新玻片的洗滌，用洗衣粉煮沸玻片1 h，然后用自來(lái)水沖洗干凈，瀝干后用95%的乙醇侵泡備用；用后玻片的洗滌，采取稀溶液洗滌法，將重鉻酸鈉或重鉻酸鉀50 g先溶解于850 mL自來(lái)水中，然后慢慢加熱溶解，待冷卻后除除加入100 mL濃硫酸，邊加邊攪動(dòng)。此溶液氧化能力極強(qiáng)，具有極強(qiáng)的去油污作用。對(duì)處理玻片應(yīng)放入溶液中加蓋密封，（以防溶液氧化變質(zhì)）。一般侵泡2 d取出沖洗干凈，瀝干后用95%的乙醇侵泡備用。如除污劑侵泡時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致玻片變質(zhì)不能使用。對(duì)劃傷較嚴(yán)重的玻片，建議不要使用， 以免影響染色效果。

1.2.2供試菌活化 為增強(qiáng)細(xì)菌的活動(dòng)力，將供試菌放在30℃的培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)活化五代（每代12 h）。然后將最后一代轉(zhuǎn)接放入31℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，作為細(xì)菌鞭毛染色的最佳時(shí)期。

1.2.3菌種稀釋孵育 取斜面活化菌種2~3環(huán)于盛有2 mL無(wú)菌水試管中，制成輕度渾濁的菌懸液，然后把試管直立于36℃水浴鍋中孵育9 min，讓菌體表面附著的鞭毛自然舒展游動(dòng)。實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)菌孵育5 min，只有部分鞭毛舒展游動(dòng)，染色效果欠佳；孵育18 min菌體鞭毛染色明顯很大，與真實(shí)細(xì)菌差異較大；超過(guò)25 min后鞭毛從菌體上自然脫落，染色效果較差。孵育好的菌懸液在操作時(shí)不要用手搖動(dòng)試管，避免鞭毛脫落影響染色效果。

1.2.4染液配制 鞭毛染液由媒染液和染色液組成。媒染液由單寧酸5 g，三氯化鉄 1.5 g，氫氧化鈉﹙1%﹚1.0 g，福爾馬林（15%）2.0 mL，蒸餾水100mL組成；染色液由硝酸銀2 g，氫氧化氨（N滴），蒸餾水100 mL組成。

1.2.4.1媒染液配制 把稱量丹寧酸和三氯化鐵藥品同時(shí)放入100 mL蒸餾水中加熱熔解，然后加入2 mL甲醛溶液和1mL NaoH，待藥液混合后補(bǔ)足水量，過(guò)濾備用。將該液置冰箱內(nèi)保存3~7 d。仍能使用。

1.2.4.2染色液配制 須把握二個(gè)環(huán)節(jié)：第一個(gè)環(huán)節(jié)（褐色變?yōu)槌吻宓倪^(guò)程）：在100 mL硝酸銀溶液中取10 mL作回滴液，然后在90 mL溶液中滴加氫氧化銨，使無(wú)色的硝酸銀溶液全部變?yōu)楹稚珪r(shí)，繼續(xù)滴加氫氧化銨至到溶液中的褐色沉淀剛剛消失變澄清為止；第二個(gè)環(huán)節(jié)(沉淀消失變?yōu)榉€(wěn)定薄霧狀的過(guò)程)：澄清硝酸銀溶液滴加回滴液，當(dāng)出現(xiàn)白霧，輕輕搖動(dòng)后，薄霧狀沉淀又消失，再繼續(xù)小心滴加，直到搖動(dòng)后出現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀，停止加入回滴液即可。密封保存冰箱內(nèi)3~7 d方可使用。

1.2.5制片染色 節(jié)用鑷子在95%乙醇溶液中夾起一塊載玻片， 在火焰上燒去玻片上的殘留油跡， 然后把玻片放在桌面上形成一定的傾斜度，在玻片的上端滴上一滴孵育后的菌懸液，讓?xiě)乙簭牟Ｆ囊欢司徛飨蛄硪欢?，用吸水紙吸去玻片下端的多余菌液，在室溫下自然干燥。?dāng)制片干燥出現(xiàn)一條淺灰色的菌膜帶為止。取少量媒染液覆蓋在菌膜上媒染4 min，用蒸餾水沖洗至玻片下端流出無(wú)藍(lán)色的清水為止，繼續(xù)用染色液沖去殘水，然后在涂片上滴加大量的染色液染色，當(dāng)涂片染色部分變?yōu)樯詈稚珪r(shí)，立即用蒸餾水沖洗，放置室溫下自然干燥。如在氣溫較低的情況下，若加染色液顯色較慢，可用木夾夾住染色涂片，在文火上加熱沸騰，并及時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染色液，待染色玻片出現(xiàn)深褐色時(shí)立即用蒸餾水沖洗。自然干燥。在加熱過(guò)程中，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染色液，可避免菌體鞭毛脫落、斷裂。提高鞭毛的染色效果。

1.2.6鏡檢攝影 鏡檢前，先用3∶7的乙醚和無(wú)水酒精組成的去污劑，把顯微鏡的光學(xué)部分檫試干凈。（用去污劑保護(hù)鏡頭，并延長(zhǎng)顯微鏡的使用壽命）。油鏡觀察：把制片放到載物臺(tái)上擺正夾好，利用聚光鏡的光源，將玻片上的褐色部分滴1~2滴香柏油， 用粗調(diào)把高倍鏡慢慢放下和油接觸（動(dòng)作要輕避免損壞玻片和鏡頭），然后利用推進(jìn)器移動(dòng)在視野內(nèi)觀察菌體鞭毛。實(shí)驗(yàn)完畢后，分3步把鏡頭處理干凈，首先用檫鏡紙把鏡頭上的油檫掉，然后用去污劑把鏡頭上的殘留油跡檫干凈，最后用檫鏡紙檫一遍即可。

用生物攝影顯微鏡（YS100）觀察結(jié)果并拍攝圖片電腦保存。

2結(jié)論

2.1玻片洗滌 如玻片油污洗滌不干凈， 在制片時(shí)，菌液在斜面上滾動(dòng)不易粘膜，在干燥的玻片上形成了一些斷斷續(xù)續(xù)的斑塊性菌膜 ，細(xì)菌鞭毛堆積成團(tuán)， 鞭毛交叉粘連。說(shuō)明洗滌玻片是鞭毛染色成功不可疏忽的問(wèn)題之一。

2.2配方改進(jìn) 將原配方牛肉膏5 g，增加為10 g，蛋白胨10 g，增加到為15 g，瓊脂1.8%~2.0%減少為1.5%。此配方提供了大量的維生素生長(zhǎng)因素，使培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)更豐富，培養(yǎng)基硬度更適宜，斜面培養(yǎng)物明顯比原培養(yǎng)基豐厚得多，更利于枯草桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌的鞭毛形成和生長(zhǎng)，粘質(zhì)沙雷氏菌，細(xì)菌不但鞭毛多，粗狀，鞭毛染色效果好，而且著色更容易而均勻。圖片背景淺褐色且非常干凈，見(jiàn)圖1。

圖1 粘質(zhì)沙雷氏菌（周生鞭毛）×100

2.3鞭毛生長(zhǎng)線 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果劃分為4個(gè)生長(zhǎng)期。鞭毛生長(zhǎng)初期：當(dāng)溫度為27℃時(shí)培養(yǎng)8 h，少數(shù)鞭毛生長(zhǎng)短??；鞭毛生長(zhǎng)期: 當(dāng)溫度為29℃時(shí)培養(yǎng)10 h，大部分鞭毛生長(zhǎng)細(xì)長(zhǎng)；鞭毛生長(zhǎng)最佳期: 當(dāng)溫度為31℃時(shí)培養(yǎng)12 h，鞭毛生長(zhǎng)多，粗狀，易著色且均勻，是鞭毛染色的最佳時(shí)期；鞭毛生長(zhǎng)脫落期：當(dāng)溫度為33℃時(shí)培養(yǎng)14 h，鞭毛開(kāi)始大量脫落，不利于鞭毛染色。如圖2為枯草桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌鞭毛生長(zhǎng)線，實(shí)驗(yàn)表明，若菌齡培養(yǎng)12 h，是鞭毛染色的最佳時(shí)期，其他大于或小于12 h都不利于鞭毛染色。

2.4菌液孵育 孵育溫度和時(shí)間是鞭毛染色成功的關(guān)鍵之一，細(xì)菌孵育<5 min，鞭毛只有部分舒展游動(dòng)，染色效果欠佳；孵育18 min，菌體鞭毛染色明顯與真實(shí)細(xì)菌差異較大；孵育25 min后鞭毛從菌體自然脫落，染色效果較差。

2.5水洗與媒染 如媒染后，用蒸餾水沖洗不充分，菌體鞭毛都變?yōu)樯钏{(lán)色，藍(lán)色背景并伴有大小不等的顆粒狀物；如媒染液用量過(guò)多，所產(chǎn)生的染液氣泡，在背景中形成許多灰白色的斑塊，且伴有大小不等的顆粒狀物，把握上述情況影響了制片效果。

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編輯/肖慧