自噬抑制劑3-MA在順鉑誘導骨肉瘤MG63細胞凋亡中的作用

摘要：目的研究自噬抑制劑3-MA在順鉑誘導骨肉瘤MG63細胞凋亡中的作用及其意義。方法培養(yǎng)人骨肉瘤MG63細胞；運用MTT法檢測自噬抑制劑3-MA在順鉑誘導下對骨肉瘤MG63細胞的影響；MDC染色法及流式細胞儀檢測自噬抑制劑3-MA在順鉑誘導下對骨肉瘤MG63細胞的影響；流式細胞儀檢測自噬抑制劑3-MA在順鉑誘導下對骨肉瘤MG63細胞凋亡的變化。結果通過MTT法發(fā)現(xiàn)DDP可引起MG63細胞增殖率下降；與單獨應用DDP組相比，3-MA+DDP組引起MG63細胞增殖率明顯下降；MDC染色及流式細胞儀檢測細胞自噬表達，發(fā)現(xiàn)與單獨應用DDP組相比，3-MA+DDP組自噬表達水平下降；流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)與單獨應用DDP組相比，3-MA+DDP組細胞凋亡率明顯增加。結論在自噬抑制劑3-MA的作用下，骨肉瘤MG63細胞自噬表達水平明顯下降，從而促使DDP對骨肉瘤MG63細胞的細胞凋亡明顯增加。

關鍵詞：自噬；凋亡；3-甲基腺嘌呤（3-MA）；順鉑（DDP）；骨肉瘤細胞

1實驗材料

1.1細胞來源 骨肉瘤MG63細胞購于中科院上海細胞庫。

1.2主要試劑 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、單丹黃酰尸胺（MDC）購于美國Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒購于上海碧云天公司。

1.3實驗儀器 流式細胞儀（美國BD公司）、酶標儀（美國Thermo公司）、倒置熒光顯微鏡（德國LEICA公司）、低溫高速旋轉離心機（美國Beckman公司）、細胞培養(yǎng)孔板（美國NEST公司）。

1.4試劑配制

1.4.1 MDC溶液 將1 mg MDC粉末溶于1 mL無菌水中，可獲得3 mmol/L的MDC溶液，取上述溶液100 μL加到6 mL無菌水中，獲得實驗用50 μmol/L的最終溶液，置于4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 DDP溶液 取1 mL濃度為5 mg/mL的DDP，用無菌水稀釋到250 mL，即獲得20 μg/mL的DDP用于實驗，4℃冰箱保存。

2實驗分組

該實驗分為4組：空白對照組（加入等量的培養(yǎng)液做對照）、3-MA組（僅添加濃度為12.5 μg/mL的3-MA）、DDP組（僅添加濃度為20 μg/mL的DDP）、3-MA+DDP組（12.5 μg/mL的3-MA和20 μg/mL DDP同時添加）。

3實驗方法

3.1細胞培養(yǎng) 骨肉瘤MG63細胞培養(yǎng)于提前配置好的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，其中含有100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素。在濕度飽和的情況下，培養(yǎng)于5%CO2、37°的培養(yǎng)箱中，隔天換一次培養(yǎng)液，3 d傳代1次，取適量對數(shù)生長期的細胞進行下一步實驗研究。

3.2 MTT比色法 外源性MTT在活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶作用下能夠還原成藍紫色結晶甲臜，且該結晶物質不溶于水，DMSO可使不溶于水的甲臜溶解，在490 nm波長處可以用酶標儀檢測光吸收值，在死亡細胞中不存在上述反應過程，檢測不到吸光度值，從而可以用來比較不同組之間細胞增殖率。取細胞數(shù)為1×108個/L，種植于96孔板中，分別在每孔添加等量的細胞懸液，細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)10 h后根據(jù)實驗分組在3個組中加入相應的藥物，在恒溫（37℃）5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，將每孔加入等量的MTT溶液作用4 h，然后PBS溶液洗1遍，再加入等量的DMSO溶液，搖擺15 min，然后在酶標儀上檢測不同組的吸光度值（A）。結合以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）=（實驗組A/對照組A）×100%。

3.3 MDC染色法 單丹黃酰尸胺（MDC）被細胞吸收后蓄積于嗜酸性的細胞囊泡中，在熒光顯微鏡下可以看到藍綠色或黃綠色點狀結構出現(xiàn)在細胞核周圍，經(jīng)常被用來檢測細胞自噬囊泡的存在。取處于對數(shù)生長期的骨肉瘤MG63細胞（細胞數(shù)為1×105個/mL）加入24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后根據(jù)實驗分組加入相應濃度的藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h后加入MDC溶液（濃度為50 μmol/L）避光環(huán)境中培養(yǎng)1 h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，用PBS洗滌，然后用倒置熒光顯微鏡觀察自噬空泡差異；同樣方法，經(jīng)相應藥物處理24 h后，MDC染色、4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，然后分別收集各組細胞（不能收集倒置熒光顯微鏡觀察過的細胞，以免影響細胞熒光強度），用流式細胞儀檢測不同組細胞熒光強度。

3.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 磷脂酰絲氨酸位于正常細胞膜的內側，但是在細胞凋亡的初期，磷脂酰絲氨酸從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，出現(xiàn)在細胞外環(huán)境中，也就是所謂的磷脂酰絲氨酸外翻。Annexin-V是一種分子量為35~36 KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸高親和力特異性結合。 Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒是用帶綠色熒光燈熒光探針FITC標記的Annexin，直接用流式細胞儀檢測磷脂酰絲氨酸外翻這一細胞凋亡的重要特征，可以使壞死細胞呈綠色熒光。而碘化丙啶（PI）可以將壞死細胞和凋亡晚期失去細胞膜完整性的細胞染成紅色。因正常細胞不被FITC和PI染色，所以二者結合可以較準確檢測細胞凋亡情況。將細胞數(shù)為1×105個/mL的骨肉瘤MG63細胞種植于6孔板中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，結合試驗分組加入相應藥物干預24 h，然后分組收集、離心細胞，PBS洗滌，按照Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒說明進行操作，經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡率，比較各組間差異。實驗重復3次。

3.5統(tǒng)計學分析 用均數(shù)±標準差（x±s）表示實驗結果，在SPSS 17.0統(tǒng)計軟件幫助下進行統(tǒng)計學分析，多組間差異用單因素方差分析進行比較，取P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

4結果

4.1 MTT法檢測各組細胞增殖抑制率 MTT法檢測結果顯示：與對照組相比，單獨添加3-MA對細胞增殖沒有明顯影響；單獨添加DDP細胞增殖率為（47.6±3.1）%；與單獨添加DDP相比，同時添加3-MA和DDP組細胞增殖率為（27.1±2.8）%，增殖率下降，P<0.05，具有統(tǒng)計學意義。

4.2 MDC染色檢測細胞自噬 MDC染色后在細胞核周圍出現(xiàn)黃綠色的自噬空泡，與單獨添加DDP組相比，3-MA和DDP同時添加組細胞自噬空泡較少。經(jīng)倒置熒光顯微鏡拍片后顯示，見圖1。通過流式細胞儀檢測各組熒光強度差異，結果提示：對照組為（83.1±8.2）%，單獨添加3-MA組為（89.8±9.5）%，單獨添加DDP組為（183.1±14.8）%，3-MA和DDP同時添加組為（121.5±10.4）%。3-MA和DDP同時添加組與單獨添加DDP組相比，P<0.05，具有統(tǒng)計學意義。

圖1 不同組MDC染色后自噬空泡的變化

4.3流式細胞術檢測細胞凋亡 經(jīng)流式細胞儀檢測我們發(fā)現(xiàn)，單獨添加3-MA組細胞凋亡率為（2.5±0.4）%；單獨添加DDP組為（12.5±1.1）%，與對照組相比，P<0.05；3-MA和DDP同時添加組為（24.6±2.4）%，與單獨添加DDP組相比，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖2。

圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

5討論

骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性是決定治療效果的關鍵因素，據(jù)統(tǒng)計仍有10%~25%患者對化療反應較差，根本原因在于對化療藥物產生耐藥性[1-2]。另外，臨床上不合理、不規(guī)范的使用化療藥物也可引起腫瘤細胞對藥物產生耐藥性，將嚴重影響治療效果。近些年多數(shù)研究[3-4]認為骨肉瘤的耐藥性與多種腫瘤基因位點或傳導通路有關，如骨肉瘤的生長、發(fā)展或耐藥性與信號傳導子STAT3通路的激活存在一定的相關性；腫瘤細胞對甲氨蝶呤耐藥與異位轉染miR-140存在聯(lián)系等。由于新的化療方案的實施，外加新的化療輔助藥物的應用，能很大程度上控制骨肉瘤的發(fā)展，產生良好治療效果[5-6]。為了尋找更有效、更廣泛的腫瘤化療輔助藥物，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對腫瘤耐藥性的影響日益引起大家的關注[7-8]。

順鉑屬于細胞周期非特異性藥物，結構類似于雙功能烷化劑，在DNA復制過程中發(fā)揮抑制作用。在骨肉瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌等實體惡性腫瘤中應用較廣泛。自噬是細胞通過自身來消除細胞內部衰老或死亡細胞來維持內環(huán)境穩(wěn)定的過程。3-甲基腺嘌呤可以通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ClassⅢPI3K），阻止自噬體與溶酶體形成自噬溶酶體，進而發(fā)揮抑制作用，是一種常見的自噬抑制劑，廣泛應用于自噬相關基礎研究[9]。MDC是特異性自噬體標記物，被MDC染色的細胞核周圍可見藍綠色或黃綠色點狀結構，常用來檢測細胞自噬囊泡[10]。

本研究結合臨床中順鉑在骨肉瘤化療中的應用，借助自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤來說明自噬在骨肉瘤化療過程中的作用。經(jīng)MTT比色法檢測，我們發(fā)現(xiàn)3-MA+DDP組細胞增殖率明顯低于單獨添加DDP組，P<0.05，說明抑制自噬可以增加DDP對細胞殺傷力。MDC熒光染色結果說明3-MA+DDP組細胞自噬空泡減少，流式細胞儀檢測熒光強度也較低，與單獨添加DDP組相比，P <0.05，表明3-MA抑制DDP誘導的自噬表達。從流式細胞術檢測結果中我們不難發(fā)現(xiàn)，與單獨添加DDP組相比，3-MA和DDP同時添加組細胞凋亡率明顯增加，說明抑制自噬可以促進骨肉瘤細胞MG63凋亡。通過本研究這四組間比較我們發(fā)現(xiàn)DDP不僅可以誘導骨肉瘤MG63細胞發(fā)生自噬和凋亡，并且通過抑制自噬可以促進骨肉瘤MG63細胞凋亡。綜上所述，自噬在順鉑誘導骨肉瘤MG63細胞凋亡中發(fā)揮積極的保護作用。

隨著人們對自噬與腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制研究的深入，我們不難發(fā)現(xiàn)通過調控自噬可以克服腫瘤耐藥性，促進細胞凋亡，為臨床獲得良好的治療效果提供實驗依據(jù)，該研究也證實調控自噬在改進腫瘤治療方案中有更寬闊的研究前景。但是如今，自噬抑制劑不能在臨床上應用的主要原因主要有：①自噬在臨床上還沒有特異性的抑制劑，實驗中應用的藥物還不能直接應用于臨床。②在臨床上對自噬水平的檢測到目前為止還沒有一個客觀定量的方法，比如根據(jù)一個血液標本或者腫瘤組織就可以檢測到自噬水平。這兩點也正是我們下一步繼續(xù)努力研究的方向。

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編輯/張燕