復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病陰道局部細(xì)胞因子的水平

摘要：目的 通過(guò)檢測(cè)陰道局部IFN-γ、IL-10的水平，探討陰道局部免疫功能與復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病發(fā)病的關(guān)系。方法 選取婦科就診及體檢的育齡婦女，健康婦女28例、VVC 30例、RVVC 30例，留取陰道灌洗液離心，ELISA法檢測(cè)上清液中IFN-γ和IL-10的濃度，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞成分中IFN-γ、IL-10mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 ①RVVC、VVC、健康組IFN-γ蛋白水平為：1.67±0.14、1.81±0.16、1.92±0.12×100pg/ml，患病兩組的表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P<0.05），RVVC和VVC組之間的表達(dá)水平也有差異（P<0.05），IFN-γmRNA表達(dá)結(jié)果與蛋白水平一致；②RVVC、VVC、健康組IL-10蛋白水平為：1.14±0.19、1.07±0.16、0.67±0.15×100pg/ml，患病兩組的表達(dá)水平均明顯高于健康組（P<0.05），但患病兩組間的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05），mRNA的表達(dá)與蛋白水平一致。結(jié)論 外陰陰道假絲酵母菌病的發(fā)病和復(fù)發(fā)可能與陰道局部細(xì)胞因子水平表達(dá)異常有關(guān)。

關(guān)鍵詞：復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌??；IFN-γ；IL-10；ELISA；RT-PCR

外陰陰道假絲酵母菌病（Vulvovaginalcandidiasis， VVC）是一種常見的女性生殖道感染疾病，75%的女性一生至少患過(guò)一次VVC[1]。1年中發(fā)作4次及以上有癥狀的VVC稱為復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌?。≧ecurrentvulvovaginalcandidiasis， RVVC）。本研究通過(guò)測(cè)定患者陰道灌洗液中干擾素-γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）的水平，探討其在VVC和RVVC發(fā)病機(jī)制中的作用，以期為該病的病因?qū)W和免疫治療方面提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取婦科就診及體檢的育齡非妊娠婦女為研究對(duì)象，按疾病類型分為健康組，VVC組和RVVC組，所有研究對(duì)象無(wú)內(nèi)外科疾病及免疫缺陷病，6個(gè)月內(nèi)未服用甾體類激素，1w內(nèi)無(wú)性生活及陰道用藥史。婦科檢查除VVC外無(wú)其他生殖道感染疾病、無(wú)陰道出血。

1.2 標(biāo)本采集5ml生理鹽水沖洗宮頸管、陰道上段，后穹窿回抽4~5ml，所有灌洗液均不含血液成分，以3000r/min 離心5min，分離上清液和細(xì)胞成分，分別置于-20℃和-80℃的冰箱凍存。

1.3 方法上清液采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定，細(xì)胞成分采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法半定量測(cè)定。

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成通過(guò)Gene Bank 查詢基因序列，IFN-γ上游引物5，-GAGGTCGAAGAGCATCCCAG-，下游引物5，-GCTTAGGTTGGCYGCCTAGT-3，；IL-10上游引物5，-ACATCAAGGCGCATGTGAAC-3，，下游引物5，-GCCACCCTGATGTCTCAGTT-3，。

1.3.2 RT-PCR步驟Trizol提取細(xì)胞成分的RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)條件為42 ℃，50 min；用RotorGene 3000 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃，15 s； 59 ℃，25 s；共45個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用分析軟件Rotor-Gene計(jì)算出2-ΔΔCt值即mRNA的相對(duì)含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（x+s）表示，組間差異的比較采用方差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞因子的蛋白水平表達(dá)RVVC、VVC、健康組IFN-γ蛋白水平分別為：1.67+0.14、1.81+0.16、1.92+0.12×100pg/ml，患病兩組的表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P<0.05），RVVC和VVC組之間的表達(dá)水平也有差異（P<0.05）；RVVC、VVC、健康組IL-10蛋白水平分別為：1.14±0.19、1.07±0.16、0.67±0.15×100pg/ml，患病兩組的表達(dá)水平均明顯高于健康組（P<0.05），但患病兩組間的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。

2.2 細(xì)胞因子的基因水平表達(dá)RVVC、VVC、健康組IFN-γmRNA分別為：0.44±0.22、0.83±0.23、1.00±0.00，患病兩組的表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P<0.05），RVVC和VVC組之間的表達(dá)水平也有差異（P<0.05）；RVVC、VVC、健康組IL-10mRNA水平分別為：2.50±0.41、2.38±0.38、1.00±0.00，患病兩組的表達(dá)水平均明顯高于健康組（P<0.05），但患病兩組間的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。

3 討論

近些年來(lái)，隨著對(duì)RVVC宿主免疫機(jī)制研究的逐漸深入而相對(duì)于全身免疫而言，更多的研究結(jié)果表明局部免疫異常在RVVC發(fā)病中起到重要作用，如臨床研究發(fā)現(xiàn)RVVC患者對(duì)其它粘膜假絲酵母菌病的易感性并不增加，另外口腔或皮膚粘膜患有假絲酵母菌病的婦女并不易患VVC，因此陰道局部細(xì)胞免疫功能的變化可能在RVVC發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2]。正常情況下，婦女陰道局部輔助性T細(xì)胞1（Th1）/輔助性T細(xì)胞2（Th2）處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，它們各自分泌多種細(xì)胞因子，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。Th1分泌IL-2、IFN-γ和腫瘤壞死因子等，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，可激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，使機(jī)體進(jìn)入抗真菌狀態(tài)；Th2分泌IL-4、IL-10和IL-13等，通過(guò)抑制Th1介導(dǎo)的噬菌作用增加對(duì)真菌的易感性。這兩種細(xì)胞的相互協(xié)調(diào)決定了機(jī)體對(duì)真菌的感染性或真菌在粘膜表面的共棲狀態(tài)[3]。Th1和Th2免疫應(yīng)答之間存在著負(fù)反饋?zhàn)饔?，一旦平衡被打破，?huì)出現(xiàn)一方占優(yōu)勢(shì)的局面，會(huì)引起局部免疫的異常，引發(fā)病癥。

本研究發(fā)現(xiàn)，RVVC患者無(wú)論在蛋白水平還是基因水平均表現(xiàn)為IFN-γ明顯降低，而IL-10升高，這表明RVVC 患者存在陰道局部免疫功能失調(diào)的異常。IL-10升高對(duì)Th1型因子有下調(diào)功能，IFN-γ的降低使得機(jī)體對(duì)抗真菌的能力降低，同時(shí)不能很好地抑制Th2型因子，以Th2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)，使機(jī)體加重了對(duì)該病的易感性，致使該病反復(fù)發(fā)作。這與Carvalho等發(fā)現(xiàn)用假絲酵母菌活化RVVC患者的外周血，其單核細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ明顯減少或消失的結(jié)果相一致。VVC組中，IFN-γ的降低和IL-10的升高，使得Th1/Th2之間的平衡向Th2方向偏移，Th2介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，激活嗜酸性粒細(xì)胞，產(chǎn)生一系列炎性介質(zhì)，介導(dǎo)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，這可能與臨床上部分患者出現(xiàn)外陰水腫，局部瘙癢等過(guò)敏癥狀有關(guān)[4]。另外，RVVC組患者的IFN-γ濃度較單純VVC組低，表明在RVVC患者陰道局部細(xì)胞免疫環(huán)境改變中，Th1型因子IFN-γ的降低可能在該病的反復(fù)發(fā)作中發(fā)揮了重要作用。

RVVC的發(fā)病和復(fù)發(fā)可能是多因素造成的，陰道局部細(xì)胞免疫功能的改變很可能只是因素之一，更多的細(xì)胞因子在RVVC中的發(fā)病作用需要進(jìn)一步的探討。目前關(guān)于RVVC的治療也存在許多疑問(wèn)與爭(zhēng)議，需要多項(xiàng)臨床循證試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

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[3] Mohanty S， Xess I， Hasan F， etal. Prevalence and susceptibility to fluconazole of Candida species causing vulvovaginitis[J].India J Med Res， 2007.

[4] 崔穎，王少為.復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病與陰道局部免疫環(huán)境改變的相關(guān)性[J].中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志， 2007.編輯/王海靜