PCR在大樣本低概率細(xì)菌檢驗(yàn)項(xiàng)目中的應(yīng)用研究

摘要：目的 探討PCR技術(shù)應(yīng)用于大樣本低概率細(xì)菌檢驗(yàn)項(xiàng)目的效果。方法 抽取2012年1月~2013年12月，我院體檢者的肛拭樣品23070份，采用PCR技術(shù)聯(lián)合細(xì)菌培養(yǎng)、分離、生化檢驗(yàn)以及血清鑒定進(jìn)行細(xì)菌檢驗(yàn)。結(jié)果 本組23070份樣品經(jīng)PCR檢測(cè)顯示112份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0.49%；PCR工作時(shí)間僅為傳統(tǒng)法的26.02%。結(jié)論 PCR作為大樣本低概率細(xì)菌檢驗(yàn)的過(guò)篩手段具有重要應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌檢驗(yàn)；大樣本；PCR

在臨床大樣本低概率細(xì)菌檢驗(yàn)項(xiàng)目中，由于檢測(cè)工作量較大，主觀人為因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果具有較大的影響，導(dǎo)致陽(yáng)性檢出率偏低，影響臨床診療工作的正常開(kāi)展。本研究應(yīng)用具有高敏感度和特異度的PCR技術(shù)作為大樣本低概率細(xì)菌檢驗(yàn)項(xiàng)目的過(guò)篩試驗(yàn)手段，檢測(cè)沙門菌陽(yáng)性率，現(xiàn)報(bào)道如下：

1資料與方法

1.1一般資料隨機(jī)抽取2012年1月~2013年12月，我院接受體檢者的肛拭樣品23070份，其中，男性10250份，女性12820份，年齡20~58歲，平均為（29.3±5.1）歲。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器PCR擴(kuò)增儀用TECHNE TC-512型擴(kuò)增儀，數(shù)據(jù)分析采用Tanon GIS-2018型數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)。PCR試劑盒引物均選自寶生科技有限公司，均在有效期內(nèi)，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2試劑培養(yǎng)基、WS瓊脂、診斷血清SF增菌液、雙糖管等相關(guān)培養(yǎng)基均選自上海市疾控中心提供，均在使用期限內(nèi)，均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)配置。根據(jù)沙門菌特有hilA基因，設(shè)計(jì)F及R引物，靶基因片段的長(zhǎng)度為550bp。

1.3方法分別采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離鑒定法和PCR法進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。傳統(tǒng)法為取肛拭SF菌常規(guī)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)種于WS平板上，選擇可疑菌落，置入雙糖管中生化，然后進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。PCR法為取肛拭SF菌常規(guī)培養(yǎng)，每30份作為1個(gè)混合PCR樣品，進(jìn)行PCR技術(shù)進(jìn)行陽(yáng)性篩查。篩查為陽(yáng)性的SF菌則轉(zhuǎn)種于WS平板上，選擇可疑菌落，置入雙糖管中生化，然后進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。PCR檢測(cè)過(guò)程如下：

1.3.1 DNA模板制備以棉拭子蘸滿增菌液，每30份作為1組，分別置入15ml無(wú)菌生理鹽水中進(jìn)行充分混勻，然后精確量取1ml加入1.5ml的離心管中，在15000r/min下離心分離5min，棄上清液，然后加入100μl低滲溶液，置于100℃高溫下進(jìn)行裂解10min，然后再次離心分離，取上清液，即為模板。

1.3.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)以（1.5mmol/L MgCl+20pmol引物F+0.2mmol/L dNTPs+20mmol/L Tris-Hcl+0.5% TrionX-100+50mmol/L Kcl+5%甘油）引物混合液20μl、模板3μl以及Taq酶1μl共計(jì)25μl作為反應(yīng)體系。在94℃下進(jìn)行5min預(yù)變性處理，然后在94℃下變性處理30s，改為55℃處理30s，在72℃下處理60s，重復(fù)上述循環(huán)35次，然后在72℃下進(jìn)行延伸處理5min。最后以含有0.5μg/ml溴化乙錠溶液的2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，采用數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.3 PCR結(jié)果分析對(duì)于PCR呈陰性的樣品判定為陰性，對(duì)于PCR呈陽(yáng)性的樣品，將其混合樣品接種于WS平安上，37℃下培養(yǎng)18~24h，然后選擇可疑菌落進(jìn)行分離鑒定。

2結(jié)果

2.1 PCR篩查結(jié)果本組23070份肛拭樣品按照30份為一組分為769組，經(jīng)PCR檢驗(yàn)顯示112組為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為14.56%。

2.2沙門菌陽(yáng)性檢出率112組經(jīng)PCR法檢測(cè)為陽(yáng)性樣品中，共檢出37株沙門菌，共分布在32組樣品中，檢出率為28.57%（32/112）。其中，2組檢出3株沙門菌，1組檢出2株沙門菌，其余29組各檢出1株沙門菌。沙門菌陽(yáng)性檢出率為0.16%（37/23070）。2012年全年44247份樣品中共檢出43株，檢出率為0.097%，檢出率差異顯著。

2.3時(shí)間效率比較PCR法檢出112組陽(yáng)性標(biāo)本，每組30份，共接種平板數(shù)3360塊，而傳統(tǒng)法23070份樣品均接種，接種數(shù)為23070塊。假設(shè)每塊平板接種時(shí)間為2min，則傳統(tǒng)法耗時(shí)共計(jì)46140min，為769h，以7h作為1個(gè)工作日，由1人完成工作約需要109.9d。而PCR法3360塊平板接種耗時(shí)共計(jì)6720min（112h）共計(jì)16d。PCR法較傳統(tǒng)法顯著縮短，見(jiàn)表1。

3討論

在大樣本低概率細(xì)菌檢驗(yàn)項(xiàng)目中，由于工作強(qiáng)度較大，耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果極易受檢測(cè)人員的主觀因素影響較大。應(yīng)用傳統(tǒng)方法檢測(cè)沙門菌，進(jìn)行平板分離培養(yǎng)以后，需要密切觀察菌落形態(tài)變化，稍有疏忽即可發(fā)生漏檢，影響臨床診斷及治療結(jié)果[1]。

PCR法具有檢測(cè)速度快、靈敏度高以及自動(dòng)化等特點(diǎn)，應(yīng)用于大樣本篩查能夠減少工作人員的工作量。但PCR法具有一定的假陽(yáng)性率，無(wú)法進(jìn)行活菌定量檢測(cè)[2]。臨床研究證實(shí)，在沙門菌帶菌率檢測(cè)中應(yīng)用PCR檢測(cè)相比于傳統(tǒng)方法更為快速、靈敏度更高，能夠快速排除陰性樣品，有效減少檢測(cè)人員的工作量，提高工作質(zhì)量及工作效率[3]。本研究中，PCR法的工作時(shí)間約為傳統(tǒng)法的26.02%（28.6/109.9）。此外，PCR法的陽(yáng)性檢出率為0.16%，相比于2012年同期的0.097%顯著提高。在769組樣品中，經(jīng)PCR篩查陽(yáng)性率為14.59%，而其中僅28.57%檢出存在沙門菌。可能是由于PCR篩查中存在一定的假陽(yáng)性，或者在檢查過(guò)程中部分沙門菌死亡，或者因平板分離靈敏度較低，與PCR的高靈敏度不相協(xié)調(diào)，導(dǎo)致沙門菌未被檢測(cè)出。

綜上所述，PCR用于大批量低概率細(xì)菌檢驗(yàn)項(xiàng)目可快速排出陰性樣本，針對(duì)少數(shù)陽(yáng)性樣品實(shí)施平板分離鑒定，可提高工作效率，值得推廣應(yīng)用。

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編輯/許言