摘要:目的建立較為簡(jiǎn)便的新生大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)方法并建立糖-氧剝奪細(xì)胞損傷模型。方法取新生的大鼠(24 h)大腦皮層組織,消化后種植在多聚-L-賴氨酸包被的六孔培養(yǎng)皿上,用含10%胎牛血清DEME-HG液種植,4~8 h后換再用含有B27的Neurobasal培養(yǎng)基維持飼養(yǎng)。于不同時(shí)間點(diǎn)在倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化,用免疫組化方法對(duì)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NSE染色鑒定。選取培養(yǎng)第7 d的神經(jīng)元隨機(jī)分為不作處理的對(duì)照組和過(guò)糖-氧剝奪建立細(xì)胞損傷模型組,Western blotting檢測(cè)NSE蛋白表達(dá)。結(jié)果2~8 h神經(jīng)元細(xì)胞貼壁,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),形態(tài)呈多變,突起逐漸增多,神經(jīng)元突起間相互接觸形成網(wǎng)絡(luò),培養(yǎng)7~10 d時(shí)神經(jīng)元胞體最為豐滿,通過(guò)免疫組化驗(yàn)證證明所分離培養(yǎng)的是神經(jīng)元細(xì)胞。糖-氧剝奪細(xì)胞損傷模型組NSE蛋白表達(dá)量較對(duì)照組NSE蛋白表達(dá)量明顯降低。結(jié)論該神經(jīng)元方法簡(jiǎn)單易行,神經(jīng)元純度較高,并成功的建立糖-氧剝奪神經(jīng)元損傷模型。
關(guān)鍵詞:神經(jīng)元;原代培養(yǎng);neurobasal培養(yǎng)基;B27;糖-氧剝奪;細(xì)胞模型
神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一種常用的技術(shù),廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞模型[1],可為神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病機(jī)制和神經(jīng)保護(hù)性藥物的篩選提供良好的平臺(tái)。在以往關(guān)于缺血/缺氧腦損傷的研究中,主要集中在動(dòng)物體內(nèi)研究,雖然在體試驗(yàn)更接近動(dòng)物的實(shí)際狀態(tài),但易受到其他因素影響。體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞,可以得到比較均一的細(xì)胞,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求控制神經(jīng)元細(xì)胞的生成,有利于動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,從而避免了體內(nèi)研究的許多復(fù)雜因素的影響[2]。
1資料與方法
1.1一般資料 出生后新24 h內(nèi)的SD大鼠,購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心; Neurobasal培養(yǎng)液、B27培養(yǎng)基添加劑、胎牛血清、0.25%胰酶、(life technology-GIBCO);DEME高糖培養(yǎng)基(Hyclone);神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(abcam公司);多聚-L-賴氨酸、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。無(wú)血清培養(yǎng)基: Neurobasal培養(yǎng)基+2%B27培養(yǎng)基添加劑(50x)+1% L-谷氨酰胺(200 mmol/L)+ 雙抗(100U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素),于冰箱4℃保存?zhèn)溆?;多?L-氨酸包被液:用PBS液配制0.1 mg/mL多聚-L-氨酸溶液,0.22 μm濾器過(guò)濾除菌,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2方法
1.2.1大鼠皮層神經(jīng)元的分離和培養(yǎng) 取24 h內(nèi)新生的SD大鼠,采用頸椎脫臼處死小鼠后,放入盛有75%酒精的燒杯中消毒1~2 min。在無(wú)菌的環(huán)境下用剪刀迅速斷頭,用預(yù)冷的PBS液中漂洗干凈移入另一個(gè)裝有預(yù)冷H-DEME的容器內(nèi),充分暴露大腦皮層,在顯微鏡下剝盡皮層的腦膜及血管,將皮層組織剪成碎組織塊,向剪碎的組織中加入濃度為0.05%的胰酶在37°C下進(jìn)行消化,15 min后 終止消化作用。使用1 mL進(jìn)口槍頭對(duì)組織進(jìn)行反復(fù)吹打(10次),注意動(dòng)作要輕柔,且不可產(chǎn)生氣泡。 將吹打后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入15ml的離心管中于4°C離心 1000 rpm,5 min,使用配制好的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸。200目篩網(wǎng)過(guò)濾,以1×106個(gè)細(xì)胞/mL,接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板中,每孔加含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)液2 mL,置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4~8 h后用neurbasal+B27培養(yǎng)液換全液1次,以后每隔3 d半量換液1次。培養(yǎng),4~8 h后用neurbasal+B27培養(yǎng)液換全液1次,以后每隔3 d半量換液1次。
1.2.2大鼠皮層神經(jīng)元鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)方法驗(yàn)證神經(jīng)元細(xì)胞的特異性和純度皮層神經(jīng)元培養(yǎng)到第7 d時(shí),胞體發(fā)育飽滿,取出爬片,選擇NSE作為皮層神經(jīng)元特異性標(biāo)志物,按標(biāo)準(zhǔn)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行鑒定,按說(shuō)明書步驟進(jìn)行,以PBS緩沖液代替I抗作陰性對(duì)照。隨機(jī)去3個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并照片。
1.2.3糖-氧剝奪損傷模型的建立 選取培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細(xì)胞,吸去培養(yǎng)基并用PBS液輕輕沖洗2遍,用95%氮?dú)夂?%二氧化碳?xì)怏w飽和10 min后的無(wú)糖培養(yǎng)基造成缺糖環(huán)境,在充滿氮?dú)獾?7℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育45 min,然后換回原培養(yǎng)液,在37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h。
1.2.4 Western blotting檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞的NSE蛋白表達(dá)水平 分別提取對(duì)照組和糖-氧剝奪組神經(jīng)元蛋白提取,煮沸變性,電泳2 h,封-閉1~2 h,加一抗NSE (1∶500)、4℃過(guò)夜,加HRP標(biāo)記抗兔二抗孵育1~2 h(1∶30000),曝光rad凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。
1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SigmaStat 3.5統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1 SD大鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察在倒置顯微鏡下觀察,剛種植的皮層神經(jīng)元呈圓形、體積小、透亮、單個(gè)散在分布,見(jiàn)表1。2 h后開(kāi)始有貼壁,8 h后大部分已貼壁。3~4 d細(xì)胞已有明顯的增長(zhǎng)的突起,以多級(jí)神經(jīng)元為主,胞體為三角形、梭形、橢圓形、椎體形幾不規(guī)則形。5~6 d后神經(jīng)元細(xì)胞體進(jìn)一步變大,突起增粗,連接形成網(wǎng)絡(luò)。7~8 d時(shí),細(xì)胞體積繼續(xù)增大,胞體飽滿,突起分支增大,形成致密網(wǎng)絡(luò)。14 d細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始減少。經(jīng)過(guò)氧-糖剝奪后的細(xì)胞從形態(tài)學(xué)觀察貼壁能力下降,細(xì)胞間隙增大,遮光性降低,少數(shù)細(xì)胞壞死。
圖1 體外培養(yǎng)不同時(shí)間大鼠皮層神經(jīng)元形態(tài)觀察
2.2免疫組化染色的觀察結(jié)果,見(jiàn)圖2 取第7 d的神經(jīng)元細(xì)胞,NSE免疫組化染色(DBA顯色),胞漿和突起被染成棕褐色而胞核不被染色的為陽(yáng)性細(xì)胞,整個(gè)細(xì)胞都不被染色為陰性細(xì)胞,見(jiàn)圖3C。在顯微鏡下進(jìn)行觀察,以3個(gè)視野中陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目占總細(xì)胞的比例為神經(jīng)元純度,經(jīng)鑒定神經(jīng)元純度為90%左右。
2.3 Western blotting測(cè)定對(duì)照組和糖氧剝奪損傷組中細(xì)胞NSE和β-actin表達(dá)(圖3)糖-氧剝奪細(xì)胞損傷模型組NSE蛋白表達(dá)量較對(duì)照組NSE蛋白表達(dá)量明顯降低,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖2 皮層神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫組化染色(×400)
圖3 各組中NSE蛋白的表達(dá)(*與對(duì)照組比較P<0.05)
3討論
體外培養(yǎng)神經(jīng)元是較困難的原代培養(yǎng)技術(shù),為成功培養(yǎng)出神經(jīng)元,首先應(yīng)選用新生(24 h內(nèi))大鼠,因?yàn)閯倓偝錾拇笫蟮纳窠?jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均為分化成熟,可較容易養(yǎng)活。其次是組織塊的消化、分離和接種的過(guò)程。必須嚴(yán)格控制胰酶的濃度和消化時(shí)間,可采用胰酶低濃度,延長(zhǎng)消化時(shí)間來(lái)達(dá)到消化均一的效果,盡可能的減少機(jī)械損傷。再次是培養(yǎng)基的選擇。血清培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)很不均一,從正常到凋亡都有,嚴(yán)重影響試驗(yàn)準(zhǔn)確,而無(wú)血清專用培養(yǎng)基所有的正常細(xì)胞都處于一樣的狀態(tài),要么都好,要么都差,高度一致。無(wú)血清培養(yǎng)基neurobasal是較好的培養(yǎng)基。需要的添加劑為 B27,培養(yǎng)出的細(xì)胞狀態(tài)均一,膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不分裂。
在體外培養(yǎng)神經(jīng)元基礎(chǔ)上氧-糖剝奪模型是模擬在體缺血模型,又稱\"離體缺血模型,大致可分為:化學(xué)缺血模型和氧-糖剝奪模型?;瘜W(xué)模型如氰化物可抑制養(yǎng)花磷酸化,從而阻斷了ATP的產(chǎn)生。氧-糖剝奪模型采用去氧處理過(guò)的無(wú)糖培養(yǎng)基孵育細(xì)胞,再放入缺氧箱,使細(xì)胞處于缺氧、缺糖狀態(tài)。細(xì)胞缺氧比較均一。離體細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)條件容易控制、恒定,卻可以在損傷過(guò)程中評(píng)價(jià)細(xì)胞功能,離體藥物評(píng)價(jià)和篩選可直接作用細(xì)胞。本課題組采用用95%氮?dú)夂?%二氧化碳?xì)怏w飽和10 min后的無(wú)糖培養(yǎng)基造成缺糖環(huán)境,在充滿氮?dú)獾?7℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育45 min,然后換回原培養(yǎng)液,在37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h,造成一根缺血再灌注損傷模型。經(jīng)過(guò)氧-糖剝奪后的細(xì)胞從形態(tài)學(xué)觀察貼壁能力下降,細(xì)胞間隙增大,遮光性降低,少數(shù)細(xì)胞壞死,并通過(guò)Western blotting檢測(cè)NSE蛋白表達(dá)。NSE主要存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)分泌細(xì)胞中。在缺血/缺氧致神經(jīng)元細(xì)胞損傷中,干擾了神經(jīng)元的代謝變化,神經(jīng)元細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)受損,NSE從胞漿中釋放至細(xì)胞外,則細(xì)胞中NSE含量下降,NSE的含量可敏感的反應(yīng)神經(jīng)元損傷程度。在對(duì)照組和模型組中NSE蛋白表達(dá)的差異比較,氧-糖剝奪模型組NSE蛋白明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表示達(dá)到了缺血缺氧目標(biāo),較好的模擬了急性缺血對(duì)細(xì)胞的損傷模型。
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編輯/張燕