宮頸癌中CyclinD1\\Ki-67\\P53的表達(dá)及與HPV16/18DNA感染的相關(guān)性研究

摘要：目的探討細(xì)胞周期因子CyclinD1、Ki-67、P53和HPV16/18在宮頸液基細(xì)胞上皮內(nèi)病變（CIN）及宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，研究HPV16/18感染與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達(dá)的關(guān)系。方法采用免疫組化（S-P）方法和原位雜交技術(shù)檢測(cè)50例宮頸癌組織、22例宮頸CIN以及20例正常宮頸組織中的CyclinD1、Ki-67、P53蛋白和HPV16/18DNA的表達(dá)情況。結(jié)果CyclinD1、Ki-67、P53蛋白和HPV16/18DNA在宮頸癌及CIN組中的陽性率分別為68.0%、84.0%、60.0%、80%；63.6%、68.2%、54.5%、72.7%均顯著高于正常宮頸組織10.0%、15.0%、0.0%、10.0%。且四者在宮頸癌中的陽性表達(dá)率與臨床分期、病理分級(jí)有關(guān)且呈遞增趨勢(shì)（P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P<0.05），與年齡因素?zé)o關(guān)（P>0.05），另外HPV16/18DNA表達(dá)與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)（P<0.01）。結(jié)論CyclinD1、Ki-67和P53在CIN及宮頸癌組織中高表達(dá)，HPV16/18病毒感染與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，四者均可作為臨床宮頸癌篩查指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：宮頸癌；HPV16/18DNA

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率處于第一位的惡性腫瘤，且近年來呈年輕化趨勢(shì)。人乳頭瘤病毒16，18（HPV16/18）感染與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。其與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，可通過與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白相互作用，促進(jìn)細(xì)胞無限制增長而致癌[1]。原癌基因細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）及細(xì)胞增殖抗原Ki-67都有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，其在人類多種細(xì)胞系及腫瘤細(xì)胞中存在表達(dá)異常，引起蛋白的異常表達(dá)，促使腫瘤的異常發(fā)生。P53基因則是重要的抑癌基因，其突變或失活可促使多種腫瘤的發(fā)生[2]。本文采用免疫組化（S-P）方法和原位雜交技術(shù)檢測(cè)宮頸癌組織、宮頸CIN以及正常宮頸組織中的CyclinD1、Ki-67、P53蛋白和HPV16/18DNA的表達(dá)情況。結(jié)合臨床資料探究HPV16/18感染與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達(dá)的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料收集合肥市第一人民醫(yī)院病理科2010年4月~2013年12月的行宮頸活檢或手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的宮頸癌50例，術(shù)前均未行放療、化療或激素治療。年齡29~74歲，平均年齡46.7歲。按FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)，Ia期10例、Ib期16例、IIa期24例。病理分級(jí)中，I級(jí)10例、II級(jí)23例、III級(jí)17例。宮頸CIN組織22例。正常宮頸組織20例。全部標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，厚度3~4um。正常宮頸組織的平均年齡43.4歲。

1.2免疫組化標(biāo)記方法濃縮型兔抗人CyclinD1單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人P53單克隆抗體，均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。具體染色步驟包括：脫蠟和水化，高壓加熱檸檬酸型組織抗原修復(fù)液，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，分別加此三者抗體中的一種或空白對(duì)照試劑，加酶標(biāo)聚合物，顯色，復(fù)染，脫水、透明、封片。

1.3原位雜交HPV16/18原位雜交檢測(cè)試劑盒購于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。雜交檢測(cè)具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.4結(jié)果判斷CyclinD1、Ki-67及P53陽性染色主要定位于細(xì)胞核，均以出現(xiàn)棕黃色顆粒為標(biāo)志。陽性標(biāo)記細(xì)胞的平均百分率>5為陽性。HPV16/18原位雜交以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紫蘭色顆粒為陽性標(biāo)志。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Fishers確切概率法分析，相關(guān)性分析采用非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1 CyclinD1、Ki-67、P53和HPV16/18在不同宮頸上皮組織中的表達(dá)CyclinD1、Ki-67、P53的陽性表達(dá)均位于細(xì)胞核內(nèi)，見圖1~6，50例宮頸癌中CyclinD1陽性表達(dá)34例，陽性表達(dá)率為68%，Ki-67陽性表達(dá)42例，陽性表達(dá)率為84%，P53陽性表達(dá)30例，陽性表達(dá)率為60%，見表1。

2.2 CyclinD1、Ki-67、P53及HPV16/18的表達(dá)與宮頸癌臨床病例因素間關(guān)系，見表2。

2.3 宮頸癌中HPV16/18感染與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達(dá)關(guān)系，見表3。

3討論

3.1 CyclinD1在宮頸病變中的表達(dá)情況CyclinD1在細(xì)胞周期中起正調(diào)節(jié)作用，其主要功能是與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4/6結(jié)合，促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞順利從G1期跨至S期，使得細(xì)胞發(fā)生分裂與增值，當(dāng)CyclinD1表達(dá)異常，其使得細(xì)胞發(fā)生分裂增值紊亂，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

3.2 Ki-67在宮頸病變中的表達(dá)情況Ki-67抗原始出現(xiàn)于細(xì)胞有絲分裂G1期，S期及G2期表達(dá)量增加，M期表達(dá)量至高峰，消失于分裂晚期，但G0期無表達(dá)，因半衰期短，可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增值活性。同時(shí)與腫瘤的增值、浸潤、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后均有密切聯(lián)系，是一個(gè)很可靠的腫瘤細(xì)胞增殖活性指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示；Ki-67在正常宮頸組織中低表達(dá)，但在CIN及宮頸癌中表達(dá)量顯著升高，分別為15.0%，68.4%，84.0%，宮頸癌與正常宮頸組織之間以及CIN與正常宮頸組織之間差異具有顯著性（P<0.05），宮頸癌與CIN之間需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來明確具體統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示Ki-67表達(dá)量的異常可能在正常宮頸組織發(fā)展至CIN及宮頸癌過程中起到一定的促進(jìn)作用。

3.3 P53在宮頸病變中的表達(dá)情況P53是目前最常見的腫瘤相關(guān)抑癌基因，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促其凋亡作用是通過多種信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，半衰期短，難以檢測(cè)，但突變后的P53基因半衰期較長，參與致癌作用。郭昕[3]報(bào)道發(fā)現(xiàn)P53蛋白表達(dá)量在正常宮頸組織、CIN以及宮頸癌中呈遞增趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果基本符合，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：P53在正常宮頸組織中無表達(dá)，但在CIN及宮頸癌中表達(dá)量顯著升高，分別為0.0%，68.4%，60.0%；且P53對(duì)宮頸癌中的淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。均提示P53參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，是判斷宮頸癌發(fā)生發(fā)展預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

3.4 HPV16/18感染與宮頸病變的關(guān)系HPV是一種具有專屬在上皮和黏膜表面表達(dá)的特異性DNA病毒，人類女性宮頸鱗狀上皮及柱狀上皮交界處是HPV病毒的易感部位。本實(shí)驗(yàn)對(duì)高危型HPV16/18展開研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在正常宮頸組織中無表達(dá)，但在CIN及宮頸癌中表達(dá)量顯著升高，前者分別與后兩者相比差異具有顯著性（P<0.05）。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步運(yùn)用相關(guān)分析，研究發(fā)現(xiàn)HPV16/18DNA表達(dá)與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)（P<0.01）。提示在HPV16/18DNA高表達(dá)的宮頸癌中，此三者標(biāo)記物表達(dá)量明顯增加，其可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著共同促進(jìn)作用，具體信號(hào)通路有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1]張洪文，宋麗君.HPV對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控影響的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2004，24(4):325-327.

[2]孫軍，夏和順，陳生路，等.BCL-2、P53在宮頸鱗狀上皮不典型增生.鱗狀上皮癌中表達(dá)及意義[J].中國腫瘤臨床與康復(fù)，2001，8(1):13-16.

[3]郭昕.C-MYC 和P53 在宮頸癌組織中表達(dá)及臨床意義[J].局解手術(shù)學(xué)雜志，2005，14(3):147-148.編輯/申磊