富硒酵母發(fā)酵工藝的優(yōu)化

涂 青，楊雙全，章之柱，陳秋慧，盧紅梅，徐海粟，仇治艷，陳 莉*

（1.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550025）

1817年，瑞典化學家BERZELIUS J發(fā)現(xiàn)并命名了硒元素[1]，之后人們逐漸認識到硒對人和動物的益處。1973年，世界衛(wèi)生組織將硒列為人體必需微量元素[2]，硒主要以有機硒和無機硒兩種形式存在[3]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有提高免疫、防癌、拮抗重金屬、抗氧化、抗腫瘤、保護細胞等作用[4-7]。硒在不同地區(qū)土壤中的含量有著十分明顯的差異，我國有72%的地區(qū)普遍缺硒[8]，30%的地區(qū)嚴重缺硒[9]，缺硒與克山病密切相關[10]，并可能導致兒童大骨節(jié)病[11]。中國營養(yǎng)學會建議我國成人膳食硒參考攝入量為60 μg/d[12]，硒攝入不足或攝入過量都會對人體造成不利影響，天然富硒食品無法滿足需求，因此要尋找合適的富硒產(chǎn)品來滿足人體對硒的需要[13]。富硒食品根據(jù)硒的富集途徑和方法可以分為天然富硒食品和人工轉化富硒食品[14]。天然富硒食品主要是依托作物在富含無機硒的土壤中經(jīng)過自身生物轉化形成富含有機硒的原料生產(chǎn)而得，比如富硒茶、富硒大米、富硒大蒜等，富硒獼猴桃等產(chǎn)品[15]。人工轉化主要是指利用植物、動物、微生物等作為轉化子，利用其將無機硒轉化成有機硒，進而加工生產(chǎn)富硒食品[16]，比如富硒雞蛋、富硒牛奶、富硒豬肉等。天然富硒食品受土壤環(huán)境的影響很大[17]，富硒水平常常不穩(wěn)定。因此，研究更多的趨向于利用人工轉化。

富硒酵母作為一種有機硒來源，比無機硒具有更高的生物利用率和更好的安全性，是一種理想的補硒制劑，應用前景廣闊，可以作為富營養(yǎng)添加劑應用于保健食品中，同時也可以作為發(fā)酵劑制備富硒食品[18-19]。目前關于富硒酵母的研究主要集中在菌種選育、實驗室培養(yǎng)優(yōu)化等方面，用于富硒的酵母菌主要為釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母等[20]，從自然環(huán)境中篩選到的富硒酵母，一般富硒能力較弱，培養(yǎng)過程中獲得生物量比較低，因此研究人員通過對菌株進樣誘導、優(yōu)化酵母營養(yǎng)物質及培養(yǎng)方式來提高富硒酵母富硒量及生物量[21-26]。本課題組前期從開陽地區(qū)富硒桑葚果園中分離培養(yǎng)得到的一株富硒釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY2，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有良好的富硒特性和發(fā)酵性能，有很好的開發(fā)應用潛力[20]。本研究以富硒釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY2為發(fā)酵菌種，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝提高菌體的生物量，同時比較溶氧反饋補料與擬指數(shù)補料兩種方式對富硒酵母生長及硒轉化率的影響，從而確定適宜補料方式。旨在為富硒酵母的工業(yè)化應用提供理論依據(jù)，同時也對富硒酵母在食品領域的開發(fā)利用起到積極推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

富硒釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY2：本實驗室篩選、保藏。

1.1.2 化學試劑

硒標液（硒含量為1 000 μg/mL）：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；生物素（分析純）：上海純優(yōu)生物科技有限公司；鹽酸硫胺、鄰苯二胺（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；糖蜜（總糖51.8%，還原糖12.7%，總氮2.3%，灰分12%）：廣西糖業(yè)集團有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司；碳酸鈉（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；亞硒酸鈉（分析純）：鄭州誠旺化工產(chǎn)品有限公司；濃硫酸、硝酸、甲苯（均為分析純）：重慶川東化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid-2Na，EDTA-2Na）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，121 ℃滅菌20 min備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：稀釋處理后糖蜜（以含糖量計）50.0 g/L、硫酸銨3.0 g/L、磷酸二氫鉀1.1 g/L、硫酸鎂2.0 g/L、鹽酸硫胺8.0 mg/L、生物素0.4 mg/L。115 ℃滅菌20 min。硒母液0.120 g在無菌壞境下加入滅菌后培養(yǎng)基。

補料培養(yǎng)基：稀釋處理后糖蜜（以含糖量計）200.0 g/L、硫酸銨6.0 g/L、磷酸二氫鉀2.2 g/L，115 ℃滅菌20 min。硒母液0.120 g在無菌壞境下加入滅菌后培養(yǎng)基。

硒母液：稱取4.381 1 g亞硒酸鈉蒸餾水定容于100 mL，0.22 μm過濾除菌，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設備

Biostat B 5 L發(fā)酵罐：德國貝朗國際生物工程公司；ZD-2A自動電位滴定儀：上海大普儀器有限公司；L5S 紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SMART生物顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱：上?，槴\實驗設備有限公司；ZD-85A氣浴恒溫振蕩器：常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

糖蜜預處理：將糖蜜用蒸餾水稀釋至（25±5）°Bx，用硫酸調節(jié)pH值至4.5左右，加熱煮沸，攪拌通風30 min，加石灰乳調節(jié)pH至5.0，75 ℃恒溫靜置8 h以上，取上清液[27]。

種子液制備：將低溫保存的甘油管富硒釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY2菌液在30 ℃培養(yǎng)箱融化，取1 mL接種于100 mL的酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）液體培養(yǎng)基，于30 ℃、160 r/min搖床恒溫培養(yǎng)12 h，得到種子液。

1.3.2 富硒酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化

在前期優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上（即1.1.3中發(fā)酵培養(yǎng)基），利用5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵培養(yǎng)富硒酵母。發(fā)酵條件為：30 ℃，初始pH 4.5，接種量8%，硒母液添加量20 mg/L，裝液量為2 L/5 L，調節(jié)轉速（200～600 r/min），通氣量（4～8 L/min）控制溶氧量30%以上，使用碳酸鈉（1mol/L）和稀硫酸（1 mol/L）控制發(fā)酵過程pH值為4.5，循環(huán)水控溫，消泡泵自動消泡。每隔2 h取樣檢測發(fā)酵液活菌數(shù)，生物量不再增加或者開始降低為發(fā)酵終點。以富硒酵母生物量、硒轉化率為評價指標，確定初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、硒添加量、發(fā)酵時間等發(fā)酵條件。每組實驗做3組重復。

1.3.3 富硒酵母補料方式研究

以優(yōu)化后發(fā)酵工藝在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵，每隔2 h取樣，測定酵母SY2的干質量和殘?zhí)呛?，繪制酵母SY2生長曲線和糖消耗曲線，以Logistic方程對其生物量進行擬合得出擬合生長曲線，以Luedeking-Piret方程對糖消耗量進行擬合得到糖消耗曲線[28]。根據(jù)糖消耗曲線確定補料的時間，進行擬指數(shù)補料、溶氧反饋補料2種方式補料，并以酵母生物量、酵母對糖蜜的得率，發(fā)酵液乙醇含量，硒轉化率等指標評價不同的補料方式，確定合適的補料方法。

擬指數(shù)補料：擬指數(shù)補料是一種根據(jù)菌體比生長速率制定補料速率的方法，選取適宜的比生長速率可以使菌體在較好的狀態(tài)生長[29]。補料起始時間設定為發(fā)酵第15小時開始。控制溶氧量＞30%，pH、溫度與優(yōu)化后的發(fā)酵工藝一致。補料速率計算公式[30-31]如下：

式中：F為補料速率，L/h；YG為菌體得率，g/g；μ為設定比生長速率，h-1；ρsF為補料培養(yǎng)基總糖含量，g/L；ρs起始補料時殘培養(yǎng)基糖質量濃度，g/L；V0，補料開始培養(yǎng)基體積，L；ρco，補料時菌體質量濃度，g/L；t為指數(shù)補料時間，h?？紤]實際操作可行性，參照徐富增等[29]以時間差分法進行補料，即每隔2 h更改補料速率，t小時的補料速率為t～t+2的內平均速率。

溶氧反饋補料：溶氧反饋補料方式是根據(jù)設定的溶氧量值啟動補料的方法。溶氧可以反映菌體生長快慢，當殘?zhí)浅渥悴⑶揖w生長旺盛時，菌體耗氧增大，溶氧下降；糖含量不足時，菌體由于代謝遲緩，耗氧量減少，溶氧上升。溶氧反饋補料，可以使溶氧維持在較穩(wěn)定水平，同時調節(jié)補料速率，使得菌體既不會因為糖濃度太高或溶氧不足產(chǎn)生溢流代謝生成乙醇，也不會因為糖濃度太低造成菌體生長停滯及死亡[32]。本實驗設定溶氧量＞30%時啟動溶氧反饋補料，其他條件及補料總體積與擬指數(shù)補料一致。

1.3.4 分析檢測

（1）富硒酵母總硒含量的測定

硒標準曲線繪制：參照文獻[33-34]，并做適當改動。準確吸取1 mL（硒含量1 000 μg/mL）硒標液加入錐形瓶，加入5 mL硝酸，加入玻璃珠，蓋上小漏斗，過夜冷消化，再低溫緩慢消化，直到不再冒黃棕色的煙，取下冷卻。加入2 mL 30%H2O2，稍許加熱后冷卻，用100 mL容量瓶定容，得到硒標準溶液（10 μg/L）。分別吸取硒標準溶液0、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于錐形瓶中，各加入1.0 mL 5%EDTA-2Na，4 mL 10 g/L的鄰苯二胺，加蒸餾水補齊體積至15 mL。用5 mol/L的NaOH調節(jié)pH至2.0，于暗處反應60 min。加入10 mL甲苯，保鮮膜封口，搖床振蕩（120 r/min，5 min）。將其轉移至比色管，靜置5 min，取上層有機相待測，以甲苯為參比溶液，在波長334 nm處測得吸光度值。以硒質量濃度（x）為橫坐標，波長334 nm處的吸光度值（y）為縱坐標繪制硒標準曲線，得到硒標準曲線回歸方程：y=10.333 7x+4.249 9，相關系數(shù)R2=0.999 8。

富硒酵母總硒含量的測定：稱取0.100 0 g凍干酵母粉，加入5 mL硝酸，消化操作同標樣。消化液用50 mL容量瓶定容。吸取5.0 mL加入錐形瓶，隨后操作同上。將測得吸光度值代入標準曲線回歸方程，求出硒含量。

酵母殘留無機硒的測定：稱取凍干酵母粉1.0 g，加入約25 mL水，超聲溶解10 min，用50 mL容量瓶定容，搖勻。測定步驟同上。將測得吸光度值代入標準曲線回歸方程，求出硒含量。酵母硒轉化率按計算公式如下：

（2）還原糖及乙醇含量測定

參照文獻[35]用DNS法測定還原糖；參照文獻[36]的重鉻酸鉀氧化法測定乙醇含量，并做適當改進。

（3）發(fā)酵液活菌數(shù)檢測

將發(fā)酵液稀釋適宜的倍數(shù)，取0.1 mL稀釋液加入0.9 mL次甲基藍染色液，混勻，室溫下染色10 min，立即在顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)[37]。無色透明的細胞數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為活菌數(shù)。

（4）富硒酵母生物量的測定

以菌體干質量為生物量指標，取一定量的發(fā)酵液離心后，棄上清，用蒸餾水洗滌沉淀，再離心。反復洗滌沉淀3次。將沉淀進行真空冷干燥，凍干得到的菌粉稱質量即為富硒酵母生物量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理用SPSS 23.0，F(xiàn)isher單因子多重比較對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，用不同字母表示同一因素不同水平之間差異顯著（P＜0.05）；MATLABR2016b進行模型擬合，實驗設計用Design-Expert 11.0.3，繪圖用Sigma Plot 14.0。

2 結果與分析

2.1 富硒酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化

以富硒酵母生物量、硒轉化率為評價指標，確定初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、硒添加量、發(fā)酵時間等發(fā)酵條件，結果見圖1。

由圖1A可知，初始pH值為3.5～4.5時，富硒酵母生物量隨之增加；在初始pH值為4.5時，富硒酵母生物量最大，為9.22 g/L，但與初始pH值為5.0時富硒酵母生物量差異不顯著（P＞0.05）；在初始pH值為4.5和5.5時，富硒酵母生物量有所下降。硒含量和轉化率均在pH 5.0時取得最大值。因此，選擇最適初始pH值為5.0。

由圖1B可知，在發(fā)酵溫度為28～30 ℃時，富硒酵母生物量、硒轉化率隨之增加；在發(fā)酵溫度為30 ℃時，富硒酵母生物量、硒轉化率最大，分別為8.80 g/L、76.133%；在發(fā)酵溫度為30～34 ℃時，富硒酵母生物量、硒轉化率有所下降。富硒酵母硒含量在30 ℃達到最大值后，趨于穩(wěn)定不再增大。因此，選擇最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

由圖1C可知，在接種量為2%～8%時，富硒酵母生物量、硒轉化率隨之逐漸變大；當接種量為8%時，富硒酵母生物量、硒轉化率達到最大值；當接種量為8%～10%時，富硒酵母生物量、硒轉化率有所下降，但不顯著（P＞0.05）；硒含量在接種量10%時最高。因此，選擇最佳接種量為8%。

由圖1D可知，隨著硒的添加量在20～50 mg/L范圍內增大，富硒酵母生物量和硒轉化率均隨之逐漸降低，其中生物量在硒添加量為20～30mg/L時，降低趨勢不顯著（P＞0.05）；硒含量隨著硒添加量在20～40 mg/L范圍內的增大而增大，在硒添加量為40～50 mg/L時趨于穩(wěn)定。因此，選擇最佳硒添加量為30 mg/L。

由圖1E可知，在發(fā)酵時間為16～24 h時，富硒酵母的生物量、轉化率、硒含量隨之增加；在發(fā)酵時間為24 h時，富硒酵母的生物量、轉化率、硒含量最高，分別為9.25 g/L、78.50%、2 283.36 μg/g；在發(fā)酵時間為24～36 h時，富硒酵母的生物量、轉化率、硒含量均趨于穩(wěn)定。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為24 h。

圖1 初始pH（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）、硒添加量（D）及發(fā)酵時間（E）對富硒酵母SY2生物量硒含量及硒轉化率的影響Fig.1 Effect of initial pH (A),fermentation temperature (B),inoculum (C),selenium addition (D) and fermentation time (E) on biomass,selenium content and selenium conversion rate of selenium-enriched yeast SY2

綜上所述，通過實驗確定富硒酵母最適發(fā)酵工藝為初始pH值5.0，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量8%，硒添加量30 mg/L，發(fā)酵時間24 h。

2.2 富硒酵母SY2補料培養(yǎng)方式研究

2.2.1 富硒酵母SY2生長動力學及糖消耗動力學曲線

由圖2可知，在0～5 h，酵母處于延遲期，在5～15 h，酵母細胞處于對數(shù)期，生長快速，代謝活躍；在15～20 h，菌體達到穩(wěn)定期，細胞不增加，生物量趨于穩(wěn)定；20 h后，隨著營養(yǎng)物質耗盡，代謝物積累，細胞生長停滯，發(fā)酵結束后，菌體生物量為9.77 g/L。與生長曲線相對應，在延遲期，糖消耗速率較低，殘?zhí)亲兓容^小，進入對數(shù)期后，糖被菌體快速消耗，濃度迅速降低，進入穩(wěn)定期及衰退期后，糖含量穩(wěn)定在較低水平，發(fā)酵結束后殘?zhí)呛繛?.66 g/L。菌體對糖蜜的利用率為0.195 4 g/g，與擬合方程計算值相近。

圖2 富硒酵母SY2生長動力學及糖消耗動力學曲線的擬合Fig.2 Fit of growth kinetic and carbohydrate consumption kinetic curves of selenium-enriched yeast SY2

2.2.2 富硒酵母SY2擬指數(shù)補料培養(yǎng)

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)及擬合方程的參數(shù)，對富硒酵母進行擬指數(shù)、溶氧反饋補料研究。擬指數(shù)補料設定的比生長速率按最大比生長速率的1/2，即0.193 h-1，根據(jù)生長及糖代謝曲線，補料起始時間為發(fā)酵第15小時開始，擬指數(shù)補料培養(yǎng)的流加速率變化見圖3，酵母培養(yǎng)過程見圖4。

圖3 擬指數(shù)補料培養(yǎng)的流加速率變化Fig.3 Change of the flow rate of quasi-exponential feed-batch culture

圖4 擬指數(shù)補料富硒酵母SY2培養(yǎng)過程Fig.4 Culture process of selenium-enriched yeast SY2 with quasi-exponential feed-batch

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間增長，補料速率逐步上升。擬指數(shù)補料從發(fā)酵的第15小時開始，補料速率為0.05 L/h，發(fā)酵第26小時停止補料，此時補料速率為0.30 L/h。

補料從分批發(fā)酵對數(shù)期結束開始，補料時富硒酵母生物量為9.5 g/L，殘?zhí)菫?.0 g/L。由圖4可知，隨著補料的速率的增大，菌體快速增長，菌體生物量在培養(yǎng)32 h達到最大值30.6 g/L；菌體對糖的利用速率小于流加的速率，所以殘?zhí)菨舛戎饾u上升，在26 h停止補料之后開始下降，發(fā)酵結束后殘?zhí)菫?5.6 g/L；發(fā)酵液中乙醇含量隨著殘?zhí)堑脑黾釉诤笃陂_始上升，在26 h達到最大乙醇含量9.5 g/L。整個培養(yǎng)周期為34 h，富硒酵母得率為0.252 g/g，發(fā)酵結束酵母硒含量為1 920.5 μg/g，硒的轉化率為82.7%。

2.2.3 富硒酵母SY2溶氧反饋補料培養(yǎng)

設定溶氧值＞30%時啟動溶氧反饋補料，富硒酵母SY2培養(yǎng)過程見圖5。

由圖5可知，隨著溶氧反饋補料啟動，在15～42 h內，富硒酵母生物量快速增加，殘?zhí)呛坑猩晕⑸仙?，?2～46 h內，富硒酵母生物量達到穩(wěn)定不再增加，殘?zhí)呛刻幱谳^穩(wěn)定水平，發(fā)酵結束后菌體生物量達到36.5 g/L。在整個補料過程中，發(fā)酵液中乙醇含量均處于較低和穩(wěn)定的水平，在發(fā)酵38 h時達到最高3.0 g/L。發(fā)酵結束后，殘?zhí)呛繛?5.0 g/L；溶氧反饋補料培養(yǎng)周期為46 h，富硒酵母得率為0.317g/g，富硒酵母硒含量為1759.5μg/g，硒轉化率為90.1%。

圖5 溶氧反饋補料富硒酵母SY2培養(yǎng)過程Fig.5 Culture process of selenium-enriched yeast SY2 with dissolved oxygen feedback feed-batch

2.2.4 富硒酵母SY2不同培養(yǎng)方式比較

不同發(fā)酵方式富硒酵母SY2發(fā)酵參數(shù)比較結果見表1。由表1可知，擬指數(shù)補料與溶氧反饋補料培養(yǎng)相比較，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)強度較高，酵母硒含量較高，在生產(chǎn)實踐中更有優(yōu)勢。同時，與分批發(fā)酵相比，擬指數(shù)補料與溶氧反饋補料富硒酵母生物量分別提高2.12倍、2.74倍，菌體得率分別提高29.2%、62.6%，硒轉化率分別提高6.7%、12.6%。但是硒含量均出現(xiàn)不同程度的降低，分別降低23.5%、34.8%，這可能是由于相較于分批發(fā)酵，富硒酵母生物量大量增加，有更多的富硒酵母參與轉化外部環(huán)境的硒，導致硒含量反而下降。

表1 不同發(fā)酵方式富硒酵母SY2發(fā)酵參數(shù)比較Table 1 Comparison of fermentation parameters of selenium-enriched yeast SY2 with different fermentation methods

3 結論

以5 L發(fā)酵罐進行富硒酵母發(fā)酵，確定其最適發(fā)酵工藝為：初始pH5.0，發(fā)酵溫度30℃，接種量8%，硒添加量30 mg/L，發(fā)酵時間24 h。在此優(yōu)化條件下，富硒酵母生物量為9.8 g/L，硒轉化率為77.5%。在此基礎上，進行擬指數(shù)補料與溶氧反饋補料方式發(fā)酵，與分批發(fā)酵相比，擬指數(shù)補料與溶氧反饋補料的富硒酵母生物量分別提高2.12倍、2.74倍，菌體得率分別提高29.2%，62.6%，硒轉化率分別提高6.7%，12.6%；但是硒含量均出現(xiàn)不同程度的降低，分別降低23.5%，34.8%。與溶氧反饋補料相比，擬指數(shù)補料的發(fā)酵周期短，生產(chǎn)強度較高，生產(chǎn)效率較高，在生產(chǎn)實踐中更有優(yōu)勢。