黃芩苷乙基纖維素微球鼻腔給藥系統(tǒng)的制備研究

錢余義+張劉紅+郭立瑋+朱華旭+付廷明

[摘要] 該研究采用乳劑-溶劑揮發(fā)法制備了黃芩苷乙基纖維素鼻用微球。所得微球圓整度好，載藥量及包封率分別為（33.31±0.045）%，（63.34±0.11）%，微球平均粒徑37.08 μm。XRD結(jié)果表明黃芩苷在微球中以結(jié)晶狀態(tài)存在但結(jié)晶度較原料藥有所降低。DSC結(jié)果證實(shí)藥物被包裹于載體內(nèi)部，而不同于簡(jiǎn)單的物理混合物。粉末流動(dòng)性測(cè)試顯示微球特別流動(dòng)能為3.57 mJ·g^-1;在正應(yīng)力為15 kPa時(shí)，空氣以2 mm·s^-1的速度通過(guò)微球粉末時(shí)氣壓降值為0.222 kPa。體外釋放試驗(yàn)研究結(jié)果顯示黃芩苷原料藥7 h累積釋放接近90%，而黃芩苷微球只達(dá)75%，表明微球具有一定的緩釋作用。對(duì)前7 h釋放曲線進(jìn)行模型擬合，結(jié)果顯示黃芩苷原料藥釋放符合一級(jí)模型（R²=0.990 4），微球釋放符合Riger-Peppas模型（R²=0.961 2）。離體兔鼻黏膜滲透實(shí)驗(yàn)顯示微球在7 h時(shí)單位面積累計(jì)釋放量是黃芩苷原料藥的1.56倍，為下一步體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 黃芩苷;乙基纖維素微球;乳劑-溶劑揮發(fā)法;鼻腔給藥

[收稿日期] 2014-10-20

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81274096，30873449）;江蘇省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK 2012855，BK20141465）;江蘇省科技廳產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金——前瞻性研究項(xiàng)目（BY 2012036）;江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目;江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（ZDXM）

[通信作者] 郭立瑋，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)，E-mail：guoliwei815@126.com

[作者簡(jiǎn)介] 錢余義，碩士研究生，E-mail：qianyuyione@126.com

藥物經(jīng)鼻黏膜吸收時(shí)，由于鼻黏膜表面覆蓋著眾多纖毛[1]，其清除功能使得藥物在鼻腔內(nèi)的滯留時(shí)間僅有15～30 min，使藥物吸收不完全[2]。因此如何延長(zhǎng)微球鼻腔滯留時(shí)間及提高釋藥速度是藥物經(jīng)鼻吸收的前提保證。有研究證實(shí)[3]疏水性乙基纖維素可延長(zhǎng)藥物鼻腔滯留時(shí)間，并推測(cè)其原因是乙基纖維素結(jié)合了細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺，減弱了纖毛擺動(dòng)。黃芩苷具有清除自由基及抗氧化等作用，可用于缺血性腦血管疾病的治療[4]。目前有關(guān)黃芩苷經(jīng)鼻腦靶向的研究已有報(bào)道[4-7]，但多集中于制備磷脂復(fù)合物及原位凝膠，本研究以乙基纖維素為骨架材料，制備了黃芩苷乙基纖維素微球。

1 材料

2695型高效液相色譜儀（2998型紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）;BL4100型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）;SM-1000D超聲細(xì)胞粉碎儀（南京舜瑪儀器設(shè)備儀器有限公司）;IKA T18高速分散機(jī)（德國(guó)ULTRA-TURRAX公司）;DF-1型集熱式磁力攪拌器（江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）;I-6型冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Ehrisa公司）;S-4800型冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日本JEOL公司）;Bruker Axs D8 Advance X射線粉末衍射儀（瑞士ARL公司）;LS13320激光衍射粒度分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）;FT4多功能粉末流動(dòng)性測(cè)試儀（英國(guó)FREEMAN TECHNOLOGY公司）;NETZSCH STA 449F3型熱分析儀（德國(guó)NETZSCH公司）;Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）;SHA-CA水浴恒溫振蕩器（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）;TP-6智能透皮擴(kuò)散儀（天津鑫洲科技有限公司）。

黃芩苷原料藥（純度98%，南京澤朗公司）;黃芩苷對(duì)照品（純度93.3%，批號(hào)110715-201318，中國(guó)食品藥品檢定研究院）;乙基纖維素（上海阿拉丁試劑有限公司）;二氯甲烷（南京試劑公司）;聚乙烯醇1788型（上海阿拉丁試劑有限公司）;透析袋（MWCO：20 000，上海源葉生物科技有限公司）;甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純

健康家兔（2.5～3 kg），雄性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2007-0005。

2 方法

2.1 黃芩苷乙基纖維素微球的制備[8] 精密稱取800 mg黃芩苷（baicalin，BC）分散于10 mL CH₂Cl₂中，650 W細(xì)胞粉碎儀粉碎1.5 min，另精密稱取800 mg乙基纖維素（ethylcellulose，EC）溶于10 mL CH₂Cl₂中，將BC CH₂Cl₂混懸液加入到EC CH₂Cl₂溶液中，攪拌混合均勻，作分散相。精密稱取聚乙烯醇1788型（polyvinyl alcohol，PVA）500 mg溶于100 mL蒸餾水中，作連續(xù)相。在750 r·min^-1攪拌下將分散相逐滴加入連續(xù)相，形成初乳。初乳用高速分散機(jī)11 000 r·min^-1高速剪切乳化15 s后在室溫下攪拌3 h，30 ℃繼續(xù)攪拌1 h揮盡溶劑CH₂Cl₂。所得混懸液置離心管中2 000 r·min^-1離心10 min傾去上清液，沉淀用pH 6.86磷酸緩沖液30 mL洗滌1次，蒸餾水繼續(xù)洗滌2次，凍干，過(guò)200目篩即得。endprint

2.2 微球載藥量和包封率的測(cè)定 精密稱取5 mg BC-EC微球置10 mL量瓶中，用甲醇超聲溶解并定容至刻度。按《中國(guó)藥典》方法[9]測(cè)定微球中BC含量，并按下式計(jì)算載藥量及包封率：載藥量=微球中藥物質(zhì)量/微球質(zhì)量×100%;包封率=（投藥量-未包封的藥物）/投藥量×100%。

2.3 微球表面形貌的觀察 將BC-EC微球鋪在導(dǎo)電膠布上，使其均勻攤開(kāi)，在真空條件下噴金20 mV，60 s后用S-4800型冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（SEM）觀察。

2.4 微球粒徑分布的測(cè)定 取適量BC-EC微球，利用LS13320激光衍射粒度分析儀Tornado Dry Powder System測(cè)定微球干法粒徑。

2.5 微球XRD測(cè)試 取適量BC-EC微球，BC原料藥，EC及BC原料藥、EC物理混合物，利用ARL X-TRA型X射線衍射儀，在Cu-Kβ射線，衍射角度（2θ）5°～80°，管壓40 kV，管流100 mA條件下對(duì)BC不同狀態(tài)下晶體形態(tài)進(jìn)行分析。

2.6 微球DSC測(cè)試 取適量BC-EC微球，BC原料藥，EC及BC原料藥、EC物理混合物，利用NETZSCH STA 449F3型熱分析儀，在以氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，氣流速度60 mL·min^-1，溫度范圍30～600 ℃，升溫速度10 ℃·min^-1條件下進(jìn)行差示掃描量熱分析。

2.7 微球流動(dòng)能及透氣性的測(cè)定 取適量BC-EC微球，BC原料藥，EC及BC原料藥、EC球物理混合物，利用FT4多功能粉末流動(dòng)性測(cè)試儀，在逆時(shí)針下行模式下測(cè)定各樣品的流動(dòng)能;在對(duì)各樣品施加0～15 kPa的正應(yīng)力，并保持空氣以2 mm·s^-1的速度通過(guò)粉末時(shí)測(cè)定氣壓降值以表征各樣品的透氣性。

2.8 微球體外釋放性能研究 精密稱取20 mg BC原料藥，61 mg BC-EC微球（含BC約20 mg）以5 mL人工鼻電解質(zhì)溶液[10]超聲混懸后加入已處理過(guò)的透析袋內(nèi)，置于95 mL人工鼻電解質(zhì)溶液中于34 ℃，100 r·min^-1振蕩24 h，并于0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，7，8.5，10，11.5，13，15，17，19，21，24 h時(shí)分別取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)加1 mL新鮮的釋放介質(zhì)，將取得的樣品經(jīng)12 000 r·min^-1高速離心后，進(jìn)行HPLC含量測(cè)定，計(jì)算累積釋放量（Q），并進(jìn)行釋放動(dòng)力學(xué)模型擬合。

2.9 微球離體透鼻黏膜滲透研究[11] 分離新鮮家兔鼻中隔黏膜，用生理鹽水洗除血跡，立即使用。采用TP-6智能透皮擴(kuò)散儀，有效擴(kuò)散面積0.785 cm²，接收池容積7.5 mL。于接收池內(nèi)加入磁力攪拌子和7.5 mL人工鼻電解質(zhì)溶液。將兔鼻黏膜固定在接收池和供給池之間，在34 ℃，100 r·min^-1磁力攪拌下平衡20 min后，精密稱取1.6 mg BC原料藥和5 mg BC-EC微球（含BC約1.6 mg）分別用1 mL人工鼻電解質(zhì)溶液超聲混懸后加入供給池鼻黏膜上。于0，15，30，45，60，90，120，150，180，240，300，360，420，720 min時(shí)各取樣100 μL，并補(bǔ)加等量新鮮接受液到接收池。將取得的樣品經(jīng)12 000 r·min^-1高速離心后，進(jìn)行HPLC含量測(cè)定，并按下式計(jì)算單位面積累計(jì)滲透量（Q_n），穩(wěn)態(tài)流量（J_ss）和藥物表觀滲透系數(shù)（P_app）：Q_n=（C_nV+V₀∑n-1i=1C_i）/A;J_ss=dQdt×1A;P_app=J_ss/C₀。

3 結(jié)果

3.1 微球載藥量和包封率 經(jīng)HPLC測(cè)定，微球載藥量為（33.31±0.045）%，包封率為（63.34± 0.11）%。

3.2 微球表面形貌 經(jīng)SEM觀察，微球粒徑較均一，表面具有一定的粗糙度，且有溶劑揮發(fā)后留下的微孔，具體見(jiàn)圖1。

3.3 微球粒徑分布 微球經(jīng)LS13320激光衍射粒度分析儀干法測(cè)得粒徑為D₅₀=37.08 μm，D₁₀=14.49 μm，D₉₀=73.37 μm，符合鼻腔給藥微球20～50 μm的粒徑要求[12]，具體粒徑分布見(jiàn)圖2。

3.4 微球XRD測(cè)試 經(jīng)晶型測(cè)定，EC為無(wú)定型物質(zhì);BC原料藥為晶型物質(zhì)，衍射曲線有明顯銳利的尖峰;BC-EC微球較BC，EC物理混合物結(jié)晶度降低，二者在BC原料藥特征峰處均有出峰，但峰強(qiáng)度明顯減弱，BC-EC微球減弱的更明顯，原因可能是制備過(guò)程中細(xì)胞粉碎使BC形成了較小粒度的微晶所致，見(jiàn)圖3。

3.5 微球DSC測(cè)試 經(jīng)差示掃描量熱法分析，EC有2個(gè)較寬的吸熱峰;BC原料藥在其熔點(diǎn)211.8 ℃處有一個(gè)非常明顯的吸熱峰，EC，BC物理混合物保留了EC和BC的吸熱峰，而BC-EC微球圖譜顯示BC熔點(diǎn)吸熱峰和EC前端吸熱峰共同形成了一個(gè)較寬的吸熱峰，表明BC是被包裹在EC中，而不是簡(jiǎn)單的物理混合物，見(jiàn)圖4。endprint

3.6 微球流動(dòng)能及透氣性測(cè)試 特別流動(dòng)能（SE）可以描述粉末在松散堆積狀態(tài)下的流動(dòng)性質(zhì)，EC，BC原料藥，BC，EC物理混合物，BC-EC微球的SE值分別為4.75 mJ·g^-1，6.82 mJ·g^-1，5.38 mJ·g^-1，3.57 mJ·g^-1。透氣性BC原料藥

3.7 微球體外釋放性能研究 在人工鼻電解質(zhì)溶液中BC原料藥7 h即釋放接近90%，而BC-EC微球釋放只達(dá)75%，表明微球具有一定的緩釋作用，見(jiàn)圖5。對(duì)釋放曲線前7 h即上升段進(jìn)行模型擬合，BC原料藥釋放符合一級(jí)模型（R²=0.990 4），BC-EC微球釋放則符合Riger-Peppas模型（R²=0.961 2），見(jiàn)表2。

3.8 微球離體透鼻黏膜滲透研究 在離體兔鼻黏膜滲透實(shí)驗(yàn)中，BC原料藥的J_ss=0.335 μg·cm^-2·min^-1，P_app=0.209×10^-3cm·min^-1，在7 h時(shí)單位面積累積滲透量為134.41 μg·cm^-2，BC-EC微球的J_ss=0.417 μg·cm^-2·min^-1，P_app=0.294×10^-3cm·min^-1，在7 h時(shí)單位面積累積滲透量為209.52 μg·cm^-2，是BC原料藥的1.56倍，見(jiàn)圖6。

4 討論

鼻腔是大腦與外界相通的唯一部位，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有天然聯(lián)系，因此將藥物通過(guò)鼻腔給藥使其達(dá)到腦部具有一定的可行性[14]。本研究制備了以乙基纖維素為骨架材料的黃芩苷鼻用微球。微球平均粒徑37.08 μm，且表面具有一定粗糙度，經(jīng)XRD證實(shí)微球制備未改變黃芩苷藥物晶型，但結(jié)晶度降低。DSC結(jié)果表明黃芩苷被包裹于載體內(nèi)。體外釋放顯示微球具有明顯的突釋現(xiàn)象，可一定程度上避免在體給藥后藥物吸收的不完全。微球離體兔鼻黏膜滲透實(shí)驗(yàn)顯示較黃芩苷原料藥，微球可提高藥物透過(guò)鼻黏膜的能力，這為進(jìn)一步進(jìn)行微球體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了依據(jù)。

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Studies on baicalin ethylcellulose microspheres for intranasal administration

QIAN Yu-yi， ZHANG Liu-hong， GUO Li-wei， ZHU Hua-xu， FU Ting-ming

（1.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China;

2.Jiangsu Botanical Medicine Refinement Engineering Research Center， Nanjing University of

Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

[Abstract] In this study， solvent evaporation method was used to preparing baicalin ethylcellulose microspheres for intranasal administration. The prepared microspheres were round with certain rough surface. The average drug loading and entrapment efficiency was （33.31 ± 0.045）%， （63.34 ± 0.11）%， respectively. As the characteristic crystalline peaks of baicalin were observed in the microspheres sample， the result of X-ray diffractometric analysis indicated that the baicalin was present in crystalline form after its entrapment in ethylcellulose matrix. By investigating the thermogram of microspheres sample， it was found that endothermic peak of baicalin was shifted from 211.8 ℃ to 244.2 ℃ and associated with the first broad endothermic peak of ethylcellulose. This could confirm that baicalin was loaded into ethylcellulose， nor simply physical mixture. The powder flowability test exhibited that the specific energy of microspheres was 3.57 mJ·g^-1 and the pressure drop was 2.22 mBar when air kept the speed of 2 mm·s^-1 through the powder bed with the force was 15 kPa. The consequence of the baicalin in vitro released from microspheres showed that the pure baicalin sample displayed faster （90%） release than microspheres sample （75%） in 7 h. Fitting model for release curve before 7 h， the results showed that the pure baicalin sample and the microsphere sample accorded with first order model（R²=0.990 4） and Riger-Peppas model（R²=0.961 2）， respectively. Ex vivo rabbit nasal mucosa permeability experiment revealed that the value of cumulative release rate per unit area of the microsphere sample was 1.56 times that of the pure baicalin sample. This provided the foundation for the in vivo pharmacokinetic study.

[Key words] baicalin; ethylcellulose microspheres; solvent evaporation method; intranasal administration

doi：10.4268/cjcmm20142418

[責(zé)任編輯 馬超一]endprint